Studies on Preparation and Characteristics of Monoclonal AntibodiesAgainst Enrofloxacin and Cross-Reactivity of Related Fluoroquinolones

An ester activation method was employed to couple enrofloxacin(ENFX) to the carrierproteins BSA and OVA. The conjugates ENFX-BSA and ENFX-OVA were identified with an UVspectrophotometer and amino acid automation analysis instrument, and resulted in conjugateswith 48 ENFX molecules per carrier molecule(BSA). Splenocytes from mice immunized withENFX-BSA were fused with SP2/0 myeloma cells and hybridomas secreting antibodies againstenrofloxacin were selected and cloned. Two stable monoclonal antibodies, 2C5, 5D5 of thesubclass IgG2a, were isolated. Using antibody 5D5, an indirect competitive inhibitionenzyme-linked immunosorbent assay (Ci-ELISA) was developed for the quantitative detectionof enrofloxacin and its metabolites. The IC50 of the standard curve was 21.67 ng mL^(-1) andthe limit of detection for enrofloxacin was 0.13 ng mL^(-1). This method was sensitive and hada linear range from 0.13 to I0 000ngmL^(-1) (r=-0.9782). Monoclonal antibody 5D5 exhibitedhigh relative affinity to enrofloxacin, and the cross-reactivities with ciprofloxacin,marbofloxacin, sarafloxacin and danorfloxacin were 110.8, 27.40, 71.05 and 37.41%,respectively. Three non-fluoroquinolones of cefadroxil, chloramphenicol, sulfadimethoxinewere tested and there was no cross-reaction between them.     

盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其特性

以戊二醛法将盐酸克伦特罗 (Clenbuterol,CL)连接到牛血清白蛋白 (BSA)上制备抗原(BSA -CL) ,并以BSA -CL免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与NS0细胞融合 ,建立分泌CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞培养上清的检测、鉴定 ,筛选出 1 7株高亲和力的杂交瘤细胞株 ,其中C - 4C9、C - 2D6、C - 4G1和C - 2H6的培养上清ELISA效价为 1∶5 1 2 ,1∶640 ,1∶81 0和 1∶2 5 6;腹水ELISA效价为 5× 1 0 - 6,1 .7× 1 0 - 5,2×1 0 - 6和 3.3× 1 0 - 5。 4株单抗与 β -肾上腺素激动剂沙丁胺醇的交叉反应性为 0 .79% ,与肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素及畜禽常用抗生素无交叉反应性。可以作为制备CL快速检测的特异性单克隆抗体应用     

呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的制备与免疫学特性鉴定

用碳二亚胺(DCC)一步法将对醛基苯甲酸衍生物CPAMOZ偶联于牛血清白蛋白、卵清蛋白上,合成免疫原CNPAMOZ-BSA、包被原CNPAMOZ-OVA。用紫外线扫描、SDS-PAGE进行人工抗原合成的鉴定;免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立分泌NPAMOZ mAb的细胞株;对NPAMOZ mAb的效价、敏感性和特异性进行鉴定。结果表明,CPAMOZ-BSA人工抗原分子结合比为15∶1;筛选出分泌NPAMOZ mAb的敏感特异的杂交瘤细胞1株2D11-B4,间接ELISA测定细胞培养上清,效价达到1∶(6.4×102),腹水效价为1∶(1.2×106),对NPAMOZ IC50为7.58μg/L,与其他抗生素交叉反应率低。本试验获得了抗NPAMOZ高价、敏感、特异的mAb,可用于呋喃它酮代谢物AMOZ的残留检测。     

C型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将灭活的C型FMDV背部皮下多点注射免疫BABL/c小鼠,取小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG1 500作用下融合,用有限稀释法进行亚克隆.以C型FMDV重组VP1蛋白为抗原,间接ELISA法筛选单抗.以O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒为抗原,间接ELISA法检测单抗特异性.获得2株抗C型FMDV的单抗3B3和6D5,亚型鉴定为IgG1、IgG3;腹水效价分别为1∶25 600和1∶51 200;中和效价分别为1∶1 280和1∶640;2株单抗与O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒间无交叉反应,表明这2株单抗为高特异性抗C型FMDV单抗.研究结果可为C型FMD的诊断及预防提供基础材料,也可用于病因学及免疫学研究.     

改良重氮法合成米诺环素人工抗原及结果鉴定

分别采用重氮法、戊二醛法及改良重氮法将米诺环素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原,3种方法的偶联比分别为5∶1,10∶1和15∶1;紫外光谱、红外光谱、凝胶电泳对改良重氮法合成的人工抗原进行鉴定,成功合成了人工抗原;将改良重氮法合成的人工抗原MNC-BSA免疫BALB/C小鼠,用间接ELJSA法测定抗体效价及其特异性.结果表明:小鼠血清抗体效价均在1∶12800以上,为研究制备米诺环素单克隆抗体奠定了基础.     

磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究

【目的】制备磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD)单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行检测。【方法】用重氮化法将SD偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上,合成免疫原BSA-SD和包被原OVA-SD,并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE法进行鉴定。用BSA-SD免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和阻断ELISA法筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立SD mAb细胞株,用体内诱生腹水法制备SD mAb,对SDmAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】BSA-SD人工抗原制备成功,SD与BSA的分子结合比约为10.3∶1;筛选出6B5-E4、6B5-E9、3A5-B4和2H8-G5 4株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶810、1∶256、1∶512、1∶512,腹水效价分别为1∶(8.6×106)、1∶(2.5×106)、1∶(5×106)和1∶(5×106)。6B5-E4株对SD的半数抑制浓度(IC50)为0.54μg/L。SD mAb与磺胺一甲基嘧啶交叉反应率为2.7%,与其他磺胺类药物无交叉反应性。【结论】获得了抗SD效价高、敏感、特异的mAb,可用于SD残留的快速检测。     

二氯喹啉酸人工抗原的合成

以3,7-二氯-8-喹啉羧酸、草酰氯、5-氨基戊酸(Q-5)为原料合成二氯喹啉酸半抗原,再采用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白[牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)]偶联合成相应的人工抗原。将半抗原用红外(IR)和核磁共振(1H-NMR)进行结构表征,通过紫外扫描证明二氯喹啉酸人工抗原(Q-5-BSA、Q-5-OVA)合成成功,且Q-5-BSA、Q-5-OVA的结合比分别为21∶1、17∶1。人工抗原的合成为研制二氯喹啉酸多克隆抗体及免疫试剂盒奠定了基础。     

抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体制备

【目的】制备大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体,为大片吸虫病的免疫诊断、防治等研究奠定基础。【方法】利用杂交瘤技术,以大片吸虫分泌排泄抗原为免疫原制备单克隆抗体,并用ELISA、硫氰酸盐洗脱法等方法鉴定其生物学特性。【结果】通过间接ELISA筛选及3次亚克隆后,共获得5株大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6D3、6B4、7D2、7D1和7D4。经鉴定,发现5株杂交瘤细胞染色体数为90～110条,均大于亲本细胞,其亚类鉴定分别属于IgG2b、IgM、IgM、IgG1和IgM,其轻链均为κ型;5株单克隆抗体（6D3、6B4、7D2、7D1、7D4）的上清效价分别为1∶400、1∶3200、1∶25600、1∶6400和1∶6400,腹水效价分别为1∶104、1∶104、1∶105、1∶107和1∶106;而表位测定结果表明,5株单克隆抗体中,6D3与7D1、7D2以及7D4与7D1、7D2作用于不同表位,6D3与6B4 可能识别同一表位或重叠表位,或同一表位有空间位阻,7D4与6D3以及6B4与7D4、7D1、7D2可能具有空间位阻;5株单克隆抗体的相对亲和力为：6B4＞7D4＞7D1＞6D3＞7D2;5株杂交瘤细胞株均能稳定地分泌单克隆抗体。【结论】制备获得的分泌排泄抗原单克隆抗体可用于大片吸虫病的诊断和免疫机理等方面的进一步研究。     

抗重金属铜离子单克隆抗体的制备及其免疫学特性

为制备抗Cu~(2+)的高效价、敏感、特异的单克隆抗体,采用已合成的铜离子人工抗原Cu~(2+)-ITCBEBSA免疫Balb/C小鼠,通过间接ELISA和阻断ELISA筛选备用小鼠,用细胞融合技术制备抗Cu~(2+)的单克隆抗体。结果筛选到4株特异性强、灵敏度高的杂交瘤细胞,其中杂交瘤细胞株2B8培养上清中的抗体效价采用间接ELISA检测为1∶(1.28×10~3),用其制备的腹水中抗体效价为1∶(5.12×10~5),该单克隆抗体为IgG1/κ型,对Cu~(2+)-EDTA的半数抑制质量浓度(IC_(50))为29.78μg/L,与Zn~(2+)-EDTA的交叉反应率(CR)为26.0%,与其他金属螯合物没有交叉反应,表明获得特异性较好的抗Cu~(2+)的单克隆抗体,可用于铜离子的免疫学检测。     

抗重金属Cd~(2+)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

旨在制备抗Cd2+高效价、敏感、特异的单克隆抗体(Cd2+mAb)。用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)鳌合Cd2+合成Cd-ITCBE半抗原、异硫氰酯法制备免疫抗原Cd-ITCBE-BSA和包被抗原CdITCBE-OVA,紫外分光光度法(UV)、SDS-PAGE和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)进行鉴定;用Cd-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠细胞融合技术建立抗Cd2+的单克隆抗体(Cd2+mAb)杂交瘤细胞株、体内诱生腹水法制备Cd2+mAb并鉴定其免疫学特性。结果表明,人工抗原偶联成功,Cd-ITCBE-BSA和CdITCBE-OVA中载体蛋白与Cd2+的质量浓度分别为7.1g/L、191.7mg/L和6.7g/L、130.1mg/L;筛选出1A3、2B7、2E10、4F3 4株杂交瘤细胞,其中2E10株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶(1.28×103),腹水为1∶(5.12×105),同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为7.58×108 L/moL,对Cd2+的半数抑制质量浓度(IC50)为16.3μg/L,与Hg2+的交叉反应率(CR%)为18.6%,与其他化合物无交叉反应。     

Studies on Preparation and Characteristics of Monoclonal Antibodies Against Enrofloxacin and Cross-Reactivity of Related Fluoroquinolones

An ester activation method was employed to couple enrofloxacin(ENFX) to the carrier proteins BSA and OVA. The conjugates ENFX-BSA and ENFX-OVA were identified with an UV spectrophotometer and amino acid automation analysis instrument, and resulted in conjugates with 48 ENFX molecules per carrier molecule(BSA). Splenocytes from mice immunized with ENFX-BSA were fused with SP2/0 myeloma cells and hybridomas secreting antibodies against enrofloxacin were selected and cloned. Two stable monoclonal antibodies, 2C5, 5D5 of the subclass IgG2a, were isolated. Using antibody 5D5, an indirect competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay (Ci-ELISA) was developed for the quantitative detection of enrofloxacin and its metabolites. The IC50 of the standard curve was 21.67 ng mL-1 and the limit of detection for enrofloxacin was 0.13 ng mL-1. This method was sensitive and had a linear range from 0.13 to 10 000 ngmL-1 (r=-0.9782). Monoclonal antibody 5D5 exhibited high relative affinity to enrofloxacin, and the cross-reactivities with ciprofloxacin,marbofloxacin, sarafloxacin and danorfloxacin were 110.8, 27.40, 71.05 and 37.41%,respectively. Three non-fluoroquinolones of cefadroxil, chloramphenicol, sulfadimethoxine were tested and there was no cross-reaction between them.     

诺氟沙星与牛血清白蛋白及卵清蛋白结合物的合成

采用碳二亚胺法制备诺氟沙星与牛血清白蛋白（BSA）的结合物，作为诺氟沙星酶联免疫用的免疫原。经紫外光谱法测定，每分子牛血清白蛋白连接的诺氟沙星分子数为16.1个。分别用碳二亚胺法和混合酸酐法制备诺氟沙星与卵清蛋白（OA）的结合物，作为诺氟沙星酶联免疫测定用的包被抗原。经紫外光谱法测定，每分子卵清蛋白连接的诺氟沙星分子数分别为5.8和1.9个。     

诺氟沙星与牛血清白蛋白及卵清蛋白结合物的合成

采用碳二亚胺法制备诺氟沙星与牛血清白蛋白（BSA）的结合物，作为诺氟沙星酶联免疫用的免疫原。经紫外光谱法测定，每分子牛血清白蛋白连接的诺氟沙星分子数为16.1个。分别用碳二亚胺法和混合酸酐法制备诺氟沙星与卵清蛋白（OA）的结合物，作为诺氟沙星酶联免疫测定用的包被抗原。经紫外光谱法测定，每分子卵清蛋白连接的诺氟沙星分子数分别为5.8和1.9个。     

蚯蚓体内恩诺沙星残留的检测方法研究

为进一步研究恩诺沙星对蚯蚓的生态毒理,建立了用荧光检测高效液相色谱法测定蚯蚓体内恩诺沙星残留量的检测方法。以0.1 mol·L~(-1)磷酸液(pH12)+乙腈=1+3(V/V)作为提取液,脱脂,浓缩,再用流动相溶解。液相色谱条件:荧光检测器,激发波长280nm,发射波长450nm。流动相:0.025 mol·L~(-1)磷酸/三乙胺缓冲液(pH3.0)+乙腈=83+17(V/V)。恩诺沙星标准曲线范围5~500ng·mL~(-1),对其进行3种浓度回收率测定,回收率在81%~88%之间,平均回收率为84.5%,变异系数10%以内,恩诺沙星的最低检出限为2ng·g~(-1)。对蚯蚓进行恩诺沙星滤纸染毒,浓度分别为0.16、1.6、16、32μg·cm~(-2),每个浓度设置4个平行,对照为不加恩诺沙星的超纯水,48 h后检测各个浓度下蚯蚓体内恩诺沙星的平均含量分别为1.53、16.81、113.32、120.83μg·g~(-1)。可见,蚯蚓对外源恩诺沙星有较好的吸收,但当外源药物浓度达到一定程度后,对恩诺沙星的吸收量将不再无限制增加,且趋于稳定,验证了该测试方法是简单、快速、可行的。     

透皮吸收制剂恩诺沙星搽剂的稳定性

建立了兽医透皮吸收新型制剂恩诺沙星搽剂中恩诺沙星紫外分光光度测定法,用初均速法探讨其稳定性．结果表明,用紫外分光光度法测定制剂含量平均回收率为１００．４０％ , Ｒ Ｓ Ｄ 为０．１３％ ．初均速法预测本制剂２５ ℃贮存有效期为 ２．２８ ａ,这说明该搽剂处方合理,稳定性良好,质量可靠．紫外分光光度法测定恩诺沙星搽剂含量快速简便,精确度好．     

恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性

将恩诺沙星(ENR)偶联于载体蛋白BSA,形成完全抗原(BSA-ENR)并免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备分泌抗恩诺沙星的杂交瘤细胞株,用体内诱生腹水法生产ENR单克隆抗体。结果筛选出4G1-B3,4G1-G1和4G1-B9 3株敏感特异的杂交瘤。3株单抗对ENR的半数抑制浓度(IC50)分别为1.04 ng/mL,2.44 ng/mL,4.24 ng/mL。4G1-B3与环丙沙星有0.02%的交叉反应,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%;4G1-G1和4G1-B9与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%。     

抗麦草畏多克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立麦草畏的免疫分析方法,采用碳化二亚胺法将麦草畏(DIC)与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,分别合成免疫原与包被原;用合成的免疫原免疫新西兰大白兔获得抗麦草畏多克隆抗体,该抗体效价为1∶1.28×105,且该抗体与麦草畏的结构类似物2,3,5-三氯苯甲酸、2,3,6-三氯苯甲酸、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸的交叉反应率均小于0.1%。以包被原1∶8 000和多抗溶液1∶80 000的稀释倍数为工作浓度,建立麦草畏间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法,此方法检测麦草畏的线性范围为1～100ng.mL-1,线性回归方程为y=8.684 4ln x+15.001,R2=0.994 4,最低检测限为IC20=1.779ng.mL-1;玉米粉和面粉空白样品的麦草畏添加回收实验表明,麦草畏添加值为5～30μg.kg-1时,玉米粉中的麦草畏回收率为53.08%～92.37%,面粉的回收率则分别为66.5%～94.63%。     

草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。     

兔抗2,4-D多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法(EDC),将2,4-D与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,经紫外分光光度计扫描鉴定。用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,并用合成的包被原进行ELISA试验对抗血清进行定性定量测定,结果表明,获得的抗血清效价达1.6×105。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度(5μg/mL),抗血清最佳稀释度(1∶50 000),并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在50~2 000ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系,该法检测底限为50 ng/mL。     

Production and Identification of High Affinity Monoclonal Antibodies Against Pesticide Carbofuran

To produce high-affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran, and the develop immunochemical assays for people＇s health and environmental protection, the hapten 4-[[（2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyloxy） carbonyl]- amino]-butanoic acid （BFNB） of carbofuran was synthesized and Balb/c mice were immunized by the hapten-carrier （BFNB-bovine serum albumin, BFNB-BSA） conjugates. The splenocytes of immunized mice were fused with Sp2/0 cells and the cultural supernatants of hybridoma cells were screened by the indirect enzyme-linked immunoabsorbent assay （ELISA）, based on BFNB-ovoalbumin conjugates （BFNB-OVA）. Purified monoclonal antibody （McAb） was obtained from fluids of ascites, deposited by octanoic acid and ammonium sulfate. The affinity and the specificity of McAb were characterized by ELISA or indirect competitive ELISA. A hybridoma cell line （5D3） secreting anti-carbofuran McAb had been established. The titer of culture medium and ascites was up to 1：2.048 × 10^3 and 1：1.024 × 10^6, respectively, and the subtype of the McAb was IgG1. The affinity constant of the McAb was about 2.54 × 10×9 L mol^-1, with an IC50 value of 1.18 ng mL^-1 and a detection limit of 0.01 ng mL^-1. Cross-reactivity studies showed that the McAb was quiet specific for carbofuran, as among the four analogous compounds, they were all hardly recognized （4.59 × 10^-4% for 2,3-dihydro-2,2- dimethyl-7-benzofuranol and less than 3.0 × 10^4% for others）. The prepared McAb had a very high affinity and specificity, and it could be used to develop ELISA for rapid determination of carbofuran.