硫代磷酸酯类农药通用抗原的合成与鉴定

【目的】合成具有硫代磷酸酯类农药共性结构的系列半抗原,制备此类农药的通用人工抗原。【方法】以烷氧基硫代磷酸盐和卤代羧酸为原料合成半抗原,采用¹HNMR、¹³CNMR及EIS-MS谱图对其结构进行表征。将合成的半抗原分别通过活性酯法、混合酸酐法与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联,制备免疫人工抗原和包被人工抗原。用紫外扫描法定性分析人工抗原的偶联情况,用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法间接测定其偶联比。【结果】合成了H1～H6 6种具有硫代磷酸酯类农药共性结构的半抗原,其中H1、H2为包被半抗原,H3～H6为免疫半抗原。制备了H1-OVA、H2-OVA、H3-BSA、H4-BSA、H5-BSA、H6-BSA、H2-BSA、H4-OVA和H6-OVA 9种人工抗原,其偶联比分别为9∶1、10∶1、23∶1、26∶1、39∶1、43∶1、28∶1、14∶1和12∶1。【结论】成功合成硫代磷酸酯类农药的人工抗原,为下一步用其免疫动物制备抗体进而进行有机磷农药酶联免疫分析奠定了基础。     

伏马菌素B_1人工抗原的鉴定及抗体的制备

采用戊二醛(GA)一步法将半抗原伏马菌素B1(FB1)分别与鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备2种具有免疫原性的FB1人工抗原FB1-OVA和FB1-BSA。分别采用凝胶电泳法、紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)4种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,FB1-OVA作为固相包被抗原,采用间接酶联免疫吸附法(i-ELISA)测定小鼠抗血清滴度。结果表明:4种方法均鉴定FB1人工抗原合成成功。凝胶电泳法测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别约为50 000和75 000。MALDI-TOF-MS测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别为48 009.212和74 355.301,并精确计算FB1-OVA和FB1-BSA偶联比分别为5∶1和10∶1。FB1-BSA免疫后小鼠的抗血清效价为1∶1.25×105,并具有较高灵敏度。     

氯吡脲完全抗原的合成与鉴定

氯吡脲(Forchlorfenuron)是半抗原,只有将其与载体蛋白偶联形成完全抗原才能刺激机体产生抗体。以2-氯异烟酸为基础设计并合成了半抗原CPPU-H1和CPPU-H2,并采用活性酯法分别将其与载体蛋白偶联制备完全抗原;采用质谱和核磁共振对半抗原CPPU-H1和CPPU-H2的结构进行分析,并用紫外光谱法和ELISA法对完全抗原进行鉴定。结果表明,半抗原CPPU-H1和CPPU-H2成功合成,且合成后的CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA具有吸收峰叠加效应,表明CPPU完全抗原合成成功,其偶联比分别为16.8∶1和22.3∶1;间接ELISA测定4次免疫后小鼠血清效价最高可达1∶25 600。CPPU完全抗原的制备为抗CPPU抗体的制备及免疫学方法的建立奠定了基础。     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗体制备

磺胺二甲基嘧啶(SM2)为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原。本试验将SM2重氮化后分别连接人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA),合成人工抗原,经紫外光谱扫描验证偶联结果,计算结合比分别为4∶1、3∶1。用偶联物SM2-HSA免疫新西兰白兔,以SM2-OVA为包被原,4次免疫后ELISA方法测定抗血清效价为1∶12 800。表明抗原合成成功,这为小分子药物残留的免疫学检测奠定了技术基础。     

磺胺二甲嘧啶人工抗原的合成与鉴定

采用重氮化法将磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine,SM2)与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)交联合成人工抗原SM2-BSA与SM2-OVA,并研究了SM2重氮盐的稳定性,以确保偶联反应顺利进行.通过紫外扫描、高效毛细管电泳检测合成效果,用免疫原(SM2-BSA)免疫BALB/c小鼠,检测抗血清.结果表明,SM2-BSA和SM2-OVA均偶联成功.     

环丙氨嗪人工抗原的合成与鉴定

本研究拟通过抗原合成、多克隆抗体制备等途径建立快速的环丙氨嗪酶联免疫检测方法.主要采用戊二醛桥连法,偶联半抗原环丙氨嗪和载体牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA),制备酶联检测的免疫抗原和包被抗原.经紫外光谱和气相-傅里叶-红外光谱鉴定,在紫外265 nm波长处得到环丙氨嗪-BSA吸收峰;在红外3 350～3 300 cm-1、1 660～1 500 cm-1和1 695～1 665 cm-1波长处分别得到环丙氨嗪-BSA和环丙氨嗪-OVA特征性偶联吸收峰,证实本试验人工合成的2对抗原均偶联成功.免疫抗原和包被抗原的偶联比分别达到25.9 ∶ 1、23.1 ∶ 1,为进一步制备抗血清和酶联检测方法的建立奠定了工作基础.     

溴虫腈半抗原及全抗原合成与鉴定

以杀虫剂溴虫腈为起始原料,合成了半抗原4-溴-2-(对氯苯基)-1-乙氧基甲基-5-(三氟甲基)吡咯-3-甲胺(简称CFP-NH:).通过戊二醛法将该半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到全抗原,经紫外光谱法鉴定后,用三硝基苯磺酸法(TNBS)测得2偶联物偶联比分别为22:1和15:1.以CFP-NH2-BSA免疫新西兰白兔、CFP-NH2-OVA为包被原,对其抗血清进行间接竞争酶联免疫吸附测定(ELISA),测得抗血清效价为2.56×104,抗血清竞争性抑制试验表明,溴虫腈质量浓度为40 μg/mL时,其抑制率达80%以上,进一步证明抗原合成成功.     

奶牛孕酮—卵清蛋白交联物、孕酮—牛血清白蛋白交联物的制备

采用碳二亚胺法合成孕酮—卵清蛋白交联物(P4-OVA)、孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA);用孕酮—卵清蛋白(P4-OVA)交联物作为抗原免疫兔子,获得高效价抗体;用孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA)作为包被抗原,通过牛血清白蛋白将抗原牢固地连接在酶标板上,包被后的抗原在4℃保存一年使用效果良好。为奶牛孕酮检测ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

磺胺二甲嘧啶人工抗原合成及单克隆抗体制备

采用重氮化法将SM2分别与BSA、OVA偶联,合成人工免疫抗原SM2-BSA和人工检测抗原SM2-OVA,并通过紫外光谱扫描(UV)、SDS-PAGE、红外光谱扫描(IR)验证偶联成功,偶联比分别为14:1、10.5:1.用SM2-BSA免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备了2株特异性分泌SM2抗体的杂交瘤细胞株...     

杠柳新苷T人工抗原合成及多克隆抗体制备

【目的】合成并鉴定杠柳新苷T人工抗原,制备多克隆抗体,为进一步开展杠柳新苷类化合物作用机理的研究奠定基础。【方法】以杠柳新苷T为起始反应物,与丁二酸酐反应生成杠柳新苷T的衍生物(半抗原),采用HPLC-ELSD、MS和NMR对衍生物的结构进行鉴定;将半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)进行偶联,采用紫外图谱对人工抗原进行鉴定,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定结合比;以乳化的人工抗原免疫8周龄雌性Balb/c小鼠获得杠柳新苷T的多克隆抗体,并测定其效价。【结果】成功合成杠柳新苷T的半抗原和人工抗原,半抗原和载体蛋白(BSA和OVA)的结合比分别为5∶1和7∶1。免疫小鼠后产生针对杠柳新苷T的特异性抗体,其效价为1∶1 600,对杠柳新苷T的半数抑制浓度(IC50)为12.429 4μg/mL。【结论】制备了杠柳新苷T的多克隆抗体,可以用于杠柳新苷T作用靶标的定位研究。     

邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

【目的】制备并鉴定1种新型邻苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原生成4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP),DBAP再与戊二酸酐反应,衍生生成4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)。将合成的半抗原衍生物DBCP通过活性酯法与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联,得到人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得抗血清,经间接竞争酶联免疫法(ic ELISA)检测抗体特异性。【结果】经质谱、氢核磁共振谱图鉴定,半抗原衍生物合成成功,经紫外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫试验证实偶联成功,并计算得出DBCP与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。经ic ELISA法检测,兔1和兔2的血清效价均达到1∶128 000,IC50分别为301和308 ng·m L-1,反应特异性较好。【结论】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。邻苯二甲酸人工抗原的成功制备使获得DBP多克隆抗体以及建立DBP免疫分析方法成为可能。     

溴氰菊酯人工抗原的合成及偶联比的测定

溴氰菊酯农药分子的人工抗原合成是酶联免疫分析技术的关键,利用重氮化法将合成的溴氰菊酯半抗原(±)α-氰基对氨基苯氧基苄基(1R,3R)-2,2-二甲基-3-(2,2-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯分别偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)上制得两种人工抗原。合成的两种溴氰菊酯人工抗原用于动物免疫及免疫后抗体的检测,测得它们的偶联比分别为6∶1和7∶1。     

改良重氮法合成米诺环素人工抗原及结果鉴定

分别采用重氮法、戊二醛法及改良重氮法将米诺环素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原,3种方法的偶联比分别为5∶1,10∶1和15∶1;紫外光谱、红外光谱、凝胶电泳对改良重氮法合成的人工抗原进行鉴定,成功合成了人工抗原;将改良重氮法合成的人工抗原MNC-BSA免疫BALB/C小鼠,用间接ELJSA法测定抗体效价及其特异性.结果表明:小鼠血清抗体效价均在1∶12800以上,为研究制备米诺环素单克隆抗体奠定了基础.     

伏马菌素B_1人工抗原的构建

碳化二亚胺法将伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原FB1-BSA及包被抗原FB1-OVA,比较了不同偶联条件对抗原合成的影响。紫外扫描初步显示载体蛋白与伏马菌素偶联成功。皮下注射免疫BALB/c小鼠,获抗FB1多克隆抗体,间接非竞争ELISA分析所得抗血清效价,最高可达1∶23000,间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别伏马菌素B1,与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2毒素无交叉反应。     

抗噻菌灵单克隆抗体的制备及异源IC-ELISA检测方法的建立

为建立噻菌灵酶免疫检测方法,制备3种噻菌灵的半抗原(H1、H2和H3)。利用活泼酯法制备免疫抗原H1-BSA、H3-BSA和包被抗原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA。采用杂交瘤细胞融合方法获得4株稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株,分别命名为1-4G9、1-6D3、3-1F9和3-5D4。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述4株抗体分别与3种包被抗原进行组合,从中选择出一个最优组合:H3-OVA/1-6D3。据此建立的异源IC-ELISA检测方法对噻菌灵的IC50为10.9μg.L-1,检测限(IC10)为2.2μg.L-1,与3种噻菌灵类似物的交叉反应率均小于0.1%;在自来水、苹果、梨的添加回收试验中,IC-ELISA法测定的回收率依次为95.9%～118.1%、90.0%～117.6%、74.9%～95.6%;HPLC法测定的回收率依次为92.7%～97.6%、98.9%～100.9%、91.6%～105.4%,IC-ELISA法与HPLC法测定结果基本一致。上述结果表明:抗噻菌灵单克隆抗体酶免疫检测具有很强的特异性和准确性。     

鼠源环丙沙星多克隆抗体的制备

为了制备环丙沙星(CPLX)多克隆抗体,将修饰成功的CPLX-NH2分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原—CPLX-NH2-BSA和CPLX-NH2-OVA,用CPLX-NH2-BSA免疫小鼠,获得了高效价的环丙沙星多克隆抗体.     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

甘草有效成分甘草酸人工抗原的光谱鉴定研究

对甘草有效成分甘草酸人工抗原的光谱进行了鉴定。鉴定结果表明：人工抗原的紫外光谱图与栽体蛋白和半抗原的紫外光谱相比均发生变化；经紫外分光光度计扫描，半抗原与BSA的结合比约为5：1；甘草酸人工抗原合成成功。     

食品中残留喹乙醇人工抗原的制备与鉴定

[目的]合成喹乙醇人工抗原。[方法]通过化学合成方法,将喹乙醇与琥珀酸酐反应,合成半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),通过活泼酯化法将半抗原与载体蛋白偶联制备喹乙醇全抗原。[结果]TLC、紫外光谱法的鉴定结果表明,目标半抗原合成成功;紫外光谱法鉴定结果表明,全抗原合成成功。[结论]建立了一种喹乙醇半抗原及全抗原的合成方法,为进一步制备喹乙醇抗体奠定基础。     

克百威人工抗原合成及其免疫应用

研究克百威半抗原4-[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)的新合成方法,以避免传统三光气合成法的危害。以呋喃酚为起始物,通过酯化反应和还原反应最终合成半抗原BFNB,利用质谱和核磁进行表征,结果证明半抗原BFNB合成成功。利用活性酯法将BFNB分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫原和包被原,紫外扫描计算偶联比分别为17∶1和8∶1;将免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,间接竞争酶免疫检测方法(icELISA)表明其半数抑制质量浓度(IC_(50))为0.096μg/mL,定量检测线性(IC_(20)~IC_(80))为0.023~0.403μg/mL。该研究所制备的抗原为进一步研制抗克百威单克隆抗体奠定基础。