水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。     

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种mreB基因的功能分析

为了阐明细菌杆状决定蛋白mreB基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)生物学特性及致病性的影响,采用同源重组的方法成功构建了该基因的缺失突变株、互补菌株及过表达菌株,并进行了相关表型测定。结果表明:与野生型菌株PccS1相比,缺失突变株ΔmreB菌体形态由杆状变为球形;对黄花马蹄莲和大白菜的致病性显著下降;生长能力也受到一定限制;尽管分泌胞外纤维素酶的能力、抗氧化压力和菌体沉降速率无明显变化,但蛋白酶活性、果胶酶活性、生物膜形成能力、游动性及产生碳青霉烯抗生素的能力均有不同程度的下降。互补菌株的表型得到了部分或全部恢复。qRT-PCR结果也显示:ΔmreB中几种相关致病因子的相对表达量均下调。表明:mreB与胡萝卜软腐果胶杆菌的菌体形态、生长能力和致病能力密切相关。这是首次报道mreB与植物病原菌的致病性相关。     

嗜水气单胞菌双组分系统FlrBC的功能探究

为明确双组分系统FlrBC在嗜水气单胞菌极生鞭毛合成、生物被膜形成及致病机制中的作用,通过同源重组法,以嗜水气单胞菌ZYAH72为野生菌株构建双组分系统FlrBC缺失株ΔflrB和ΔflrC,比较不同菌株鞭毛合成及游动性、生物被膜形成、胞外多糖分泌、细胞黏附以及抗全血杀伤能力差异。结果显示:与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC仍能形成极生鞭毛,细菌游动能力无显著差异;而结晶紫染色发现ΔflrB和ΔflrC相较于野生株的生物被膜形成能力分别下降了27.2%和22.3%;刚果红检测结果显示,与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC的胞外多糖分泌分别下降了18.4%和14.2%;实时荧光定量PCR的结果显示,flrB和flrC的缺失不同程度抑制了鞭毛合成、生物被膜相关通路基因的表达;与草鱼肾细胞共孵育后,ΔflrB和ΔflrC的细胞黏附率与野生株相比分别下降了23.2%和18.2%;全血杀伤实验结果显示,ΔflrB和ΔflrC抗全血杀伤能力均显著减弱。以上结果表明,双组分系统FlrBC不是嗜水气单胞菌极生鞭毛形成所必需,但在细菌鞭毛形成组装和生物被膜形成中发挥调控作用,并且影响嗜水气单胞菌致病性...     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

hpaXm和hpaXm-IP基因对棉花角斑病菌V8表型及HR的影响

试验前期通过构建相应敲除载体,采用电转化的方法,分别获得Xanthmonas.citri subsp.malvacearum(简称Xcm)菌株的hpaXm基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm-IP。通过特殊生长平板及烟草接种试验表明,与V8菌株相比,突变菌株胞外多糖产量以及胞外纤维素酶、脂酶活性不变,V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性显著降低;3种菌株都不能产生胞外蛋白酶;突变菌株在烟草上形成的坏死斑面积变小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因与病菌胞外淀粉酶活性及病菌激发烟草过敏反应的能力有关,与胞外多糖、纤维素酶、蛋白酶和脂酶产生无关。同时预示了hpaXm-IP可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力,且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激发烟草HR的活性物质,hpaXm及hpaXm-IP可能会影响V8菌株的致病性,但不是必然的。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

固氮施氏假单胞菌RpoN蛋白对鞭毛合成的影响

选择性σ因子σ~(54)(又称为RpoN)参与到许多细菌特定基因的转录起始过程,如氮同化基因、四碳二羧酸转运基因以及鞭毛基因。为了研究施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri,A1501)中σ因子RpoN对鞭毛合成的影响,构建了A1501的rpoN缺失突变株与功能回补株,并对野生型、突变株与回补株的鞭毛结构、swimming运动、生物膜形成、根际定殖能力以及鞭毛基因的表达水平进行了比较分析。结果表明:rpo N突变株丧失了鞭毛结构与swimming运动能力,根际定殖与生物膜形成能力相对野生型分别下降了25倍与10倍;此外,rpoN缺失后A1501中大量鞭毛基因发生显著下调;启动子分析发现RpoN除了可能参与调控Ⅱ级、Ⅲ级鞭毛基因外,还可能调控一级基因fli A以及四级基因fliC。以上结果说明RpoN在不同调控等级影响A1501鞭毛的合成,进而影响该菌运动、生物膜形成、根际定殖这些与水稻建立起联合固氮体系息息相关的过程。     

西瓜果斑病菌T2SS分泌蛋白的筛选和功能预测

利用KEGG和STRING数据库分析比较瓜类果斑病菌(西瓜嗜酸菌)(Acidovorax citrulli,Ac)和主要植物病原细菌Ⅱ型分泌系统(T2SS)的基因组成,收集有试验证据的植物病原细菌T2SS分泌蛋白序列信息,与已测序并经注释的果斑病菌AAC00-1菌株基因组进行序列比对,筛选出候选的果斑病菌同源T2SS分泌蛋白。通过对筛选出的分泌蛋白的信号肽、代谢通路、蛋白互作网络及其在植物细胞中的定位进行分析,预测部分分泌蛋白的生物学功能。     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

西瓜细菌性果斑病菌在不同场所存活期的检测

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。     

禾谷镰孢碳源代谢调控因子FgCreA的功能

【目的】敲除禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中碳源代谢调控因子FgCreA,并对其营养生长、有性生殖和致病力等方面进行研究,为研究禾谷镰孢中碳源代谢机制提供依据。【方法】根据酵母数据库SGD和NCBI数据库中的序列,利用酿酒酵母中碳源代谢调控因子Mig1确定禾谷镰孢中的碳源调控因子FgCreA;在NCBI数据库中检索其他物种中碳源代谢调控蛋白,使用ClustalW2软件进行多重序列比对,并用MEGA5软件构建系统进化树,同时在InterProScan网站上预测其蛋白结构域;在NCBI数据库中检索与禾谷镰孢碳源吸收相关的结构基因和真菌毒素DON生物合成的相关基因,调取起始密码子上游1 000 bp的片段,预测FgCREA基因结合位点位置;用Primer5软件设计引物,利用Split-PCR和PEG介导原生质体转化的方法进行基因敲除,并通过PCR和Southern blot验证获得FgCREA基因敲除突变体Fgcrea。根据突变体Fgcrea营养生长、有性生殖和致病力等方面的变化分析FgCREA的功能。【结果】通过生物信息学方法,明确禾谷镰孢中只有一个碳源代谢调控因子基因FgCREA(FGSG_09715),氨基酸序列416 aa,共包含两个保守的C2H2锌指结构区域。FgCreA同源蛋白在各类真菌中均存在一定程度的同源性,具有较高的保守性。禾谷镰孢碳源吸收相关结构基因（XYL2、ARA1、ICL1、PG1、SUC2）和真菌毒素DON生物合成相关基因（TRI1、TRI3、TRI4、TRI5、TRI6、TRI7、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101）启动子区均含有FgCREA DNA结合位点。采用Split-PCR技术和PEG介导的原生质体转化,通过PCR和Southern blot获得并验证了两个FgCREA基因敲除突变体。表型观察发现,突变体Fgcrea的生长速度与野生型相比下降90%;分生孢子形态正常,但产孢量与野生型相比降低88%;有性生殖阶段,突变体Fgcrea可以产生正常的子囊壳、子囊和子囊孢子,但需要比野生型长20-28 d;突变体Fgcrea对钠盐较敏感,侵染小麦穗不发病。【结论】获得禾谷镰孢碳代谢调控因子FgCreA敲除突变体,明确FgCreA参与营养生长和有性生殖,并能够影响致病过程。但是否影响相关结构基因的转录水平和DON生物合成仍需进一步验证。     

灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

【目的】明确灰葡萄孢（Botrytis cinerea）犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径之间的关系,为进一步阐明BcKMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO对cAMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO中的cAMP,利用HPLC检测各菌株中cAMP的含量;利用real-time PCR技术检测BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pkaR、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测BcKMO突变体中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变中BcKMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183对cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,BcKMO和cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pkaR、bcg3的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显低于野生型。【结论】BcKMO负调控cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达;cAMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控BcKMO的表达,而cAMP信号途径关键基因pka2、pkaR、bcg3正调控BcKMO的表达。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

水稻矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2 (ddf2)的基因定位与候选基因分析

【目的】对一个同时导致营养和生殖器官发育异常的水稻突变体进行表型鉴定、基因定位和候选基因分析,为下一步的基因克隆与功能分析奠定基础。【方法】在水稻籼型恢复系602组织培养后代中,发现一个矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2（ddf2）。抽穗期,以野生型为对照,对ddf2株高、主穗长、节间和功能叶的长宽等性状进行统计分析;同时利用冷冻切片等技术对茎、叶和花器官进行详细的形态和组织学分析。分别以西农1A和中花11为母本,以DDF2/ddf2杂合株系为父本构建2个F₂群体进行遗传分析和基因定位,并对候选基因进行实时荧光定量PCR（real-time PCR）分析。【结果】相较于野生型,突变体各节间的长和茎粗均极显著降低,叶片极显著变短、变窄,同时花序也极显著变短。组织细胞学分析发现,突变体大叶脉数目和相邻2个大叶脉之间的小叶脉数都没有明显的变化,但相邻2个大叶脉之间的宽度明显减小,进一步比较2个小叶脉之间的叶肉细胞,发现在突变体中细胞数目和尺寸均显著降低;突变体茎秆维管束的数目与野生型相比没有明显的变化,但统计发现2个大维管束之间基本组织细胞的数量和细胞的大小都显著小于野生型,表明ddf2突变体茎、叶细胞分裂和膨胀都受到了抑制;此外,ddf2突变体的花器官特征发育受到了严重干扰：第一轮外稃顶部弯曲、内稃不同程度退化,第三轮雄蕊器官严重退化,部分甚至转化为雌蕊状器官,另外部分ddf2小穗的护颖过度发育,转变成稃片状,一些小穗还表现分生组织确定性的丢失,发育出2个以上的小花。遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制。利用中花11/ddf2的1 024株F₂分离群体,最终将DDF2精细定位在第11染色体短臂近着丝粒位置处,位于insertion/deletion（in/del）标记S-11和S-14之间,遗传距离分别为0.049和0.098 cM,物理距离为90.295 kb,并与标记S-24共分离。分析定位区间的基因,发现共有MSU注释基因12个,其中一个编码Sec3_C蛋白的LOC_Os11g17600内部包含共分离标记S-24,进一步对该基因进行表达分析,发现该基因在突变体的叶、茎和穗中都表现出明显的下调,初步将LOC_Os11g17600作为DDF2候选基因。【结论】DDF2是一个同时控制水稻茎/叶和花器官发育的新基因。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。