橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。     

解淀粉芽孢杆菌HAB-6抑菌物质及其相关基因的分析

芽孢杆菌是重要的生防菌株,分析了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HAB-6菌株的抑菌物质及其抑菌活性。采用特异性PCR和液质联用(LC-MS)等方法对HAB-6菌株的抑菌物质进行初步研究。通过对编码合成脂肽类抗生素的10个基因进行PCR扩增,分别得到与yndj、srf AB、itu D、fen D、itu C同源的基因5个;扩增编码合成脂肽类物质关键合成酶基因,得到与fen B、lpa-14、sfp、myc B、itu A同源的基因5个;LC-MS结果显示,HAB-6菌株能产生C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C等脂肽类化合物,但通过与病原真菌对峙抑菌活性检测,脂肽类物质没有抑制真菌活性。结果表明,HAB-6菌株具有脂肽类物质的合成基因和相关调控基因,代谢产生伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin),但是酸沉淀提取得到的脂肽类物质不是HAB-6菌株抑制真菌的主要物质,其抑菌成分种类和代谢脂肽类物质的途径可能与已知的途径有所不同,有待进一步研究。     

枯草芽孢杆菌B43对香蕉枯萎病菌抑菌活性及其活性成分分析

为明确拮抗菌枯草芽孢杆菌B43菌株拮抗香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4，FOC-4)的能力及其抑菌活性物质的性质，本研究采用平板对峙法进行抑菌谱试验；酸沉淀、有机溶剂萃取法提取B43菌株中的抑菌活性物质并作稳定性测定；根据脂肽类抗生素合成相关基因序列对B43基因组进行PCR扩增检测，运用LC-MS对粗提物作成分分析。结果表明，B43菌株对21种植物病原真菌均有较好的抑菌活性；酸沉淀法粗提物具有较好的耐热及耐紫外线特性，但不耐强酸强碱；通过特异性引物PCR检测，B43菌株基因组中含有srfAB、ituA、ituB、ituD、fenD、yndJ、sfp、mycB、lpa-14或fenB等脂肽类合成相关基因；LC-MS分析发现粗提物中含有Surfactin、Iturin、Mycosubtilin、Bacillomycin和Fengycin 5类脂肽类抗生素的同系物24种。枯草芽孢杆菌B43菌株抑菌谱广，其发酵液酸沉淀粗提物对FOC-4具有良好的抑菌活性以及较好的稳定性，本研究不仅检测推断出粗提物中含有多种脂肽类抗生素及其同系物，且于菌株基因组中扩增出多种脂肽抗生素基因，说明该菌株可能能够产生多种脂肽类抗生素。B43菌株与已报道的多数拮抗FOC-4的芽孢杆菌菌株相比，效果好、活性物质种类更多，因此具有良好的生物农药开发应用前景。     

辣木枝枯病病原菌鉴定及其生物学特性

为明确海南省辣木枝枯病病原菌及其生物学特性,采用组织分离法获得菌株MO157,通过柯赫氏法则、形态学特征及分子生物学技术对该菌株进行鉴定,并测定了其菌丝生长的最佳条件。结果表明,菌株MO157回接10 d后,辣木茎干表面周围呈黄褐色,随后发病部位表现出水渍状病斑,与自然发病辣木的病状相符;菌落近圆形,菌丝初期呈白色绒毛状,后期呈浅黄色,分生孢子顶胞钩状,3~5个隔膜,厚垣孢子呈球形,在菌丝间串生;菌株MO157的ITS序列与Gen Bank中木贼镰刀菌Fusarium equiseti的相似性为100%,结合形态特征与分子鉴定最终将其确定为木贼镰刀菌(Gen Bank登陆号:KX197955)。该菌菌丝生长适宜温度25~30℃,最适温度28℃;pH 6~8时菌丝生长速率增快,pH 7时最适菌丝生长;PDA培养基和PSA培养基最适合该菌生长,以蔗糖为碳源时利用率最高;以牛肉浸膏为氮源时利用率最高;该菌致死温度为65℃,10 min;光照对菌丝生长影响较小,不同处理间菌落直径无显著差异。