禾谷镰孢碳源代谢调控因子FgCreA的功能

【目的】敲除禾谷镰孢(Fusarium graminearum)中碳源代谢调控因子FgCreA,并对其营养生长、有性生殖和致病力等方面进行研究,为研究禾谷镰孢中碳源代谢机制提供依据。【方法】根据酵母数据库SGD和NCBI数据库中的序列,利用酿酒酵母中碳源代谢调控因子Mig1确定禾谷镰孢中的碳源调控因子FgCreA;在NCBI数据库中检索其他物种中碳源代谢调控蛋白,使用Clustal W2软件进行多重序列比对,并用MEGA5软件构建系统进化树,同时在Inter Pro Scan网站上预测其蛋白结构域;在NCBI数据库中检索与禾谷镰孢碳源吸收相关的结构基因和真菌毒素DON生物合成的相关基因,调取起始密码子上游1 000 bp的片段,预测FgCREA基因结合位点位置;用Primer5软件设计引物,利用Split-PCR和PEG介导原生质体转化的方法进行基因敲除,并通过PCR和Southern blot验证获得FgCREA基因敲除突变体Fgcrea。根据突变体Fgcrea营养生长、有性生殖和致病力等方面的变化分析FgCREA的功能。【结果】通过生物信息学方法,明确禾谷镰孢中只有一个碳源代谢调控因子基因FgCREA(FGSG_09715),氨基酸序列416 aa,共包含两个保守的C2H2锌指结构区域。FgCreA同源蛋白在各类真菌中均存在一定程度的同源性,具有较高的保守性。禾谷镰孢碳源吸收相关结构基因(XYL2、ARA1、ICL1、PG1、SUC2)和真菌毒素DON生物合成相关基因(TRI1、TRI3、TRI4、TRI5、TRI6、TRI7、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101)启动子区均含有FgCREA DNA结合位点。采用Split-PCR技术和PEG介导的原生质体转化,通过PCR和Southern blot获得并验证了两个FgCREA基因敲除突变体。表型观察发现,突变体Fgcrea的生长速度与野生型相比下降90%;分生孢子形态正常,但产孢量与野生型相比降低88%;有性生殖阶段,突变体Fgcrea可以产生正常的子囊壳、子囊和子囊孢子,但需要比野生型长20—28 d;突变体Fgcrea对钠盐较敏感,侵染小麦穗不发病。【结论】获得禾谷镰孢碳代谢调控因子FgCreA敲除突变体,明确FgCreA参与营养生长和有性生殖,并能够影响致病过程。但是否影响相关结构基因的转录水平和DON生物合成仍需进一步验证。

The Function of the Carbon Metabolism Regulator FgCreA in Fusarium graminearum