西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析

【目的】西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一种严重的世界性病害。细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官,在细菌的侵染过程中也起重要作用,已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控,目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其调控机理尚不清楚,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段,通过回收、酶切、连接、转化等步骤构建敲除载体和互补载体,然后采用三亲杂交法,根据同源重组的原理,构建fliS基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对其鞭毛的形态特征、致病性、过敏反应、游动性、群体感应、菌膜、生长速率、菌落形态等生物学特性进行测定;进一步提取细菌总RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA为参照来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flh D、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表达量差异。【结果】通过抗性基因Gm的筛选和PCR验证,成功构建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突变菌株1-fliS及其互补菌株1-fliShb,并对所得菌株的生物学特性和鞭毛进行观察,结果表明,与野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突变菌株的游动性、菌膜形成能力减弱,互补后游动性、菌膜形成能力基本恢复;缺失突变菌株对甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果实的致病性降低,互补后对西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果实的致病力完全恢复。电镜测试显示,突变菌株鞭毛变短,长度约为野生菌株的1/3—1/4,互补后鞭毛合成能力基本恢复,鞭毛长度约为野生菌的4/5;光学显微镜下,可观察到在NA平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊晕圈,而缺失突变菌株在NA平板上不能形成这种晕圈,互补后晕圈形成能力部分恢复;缺失突变菌株的生长速率比野生菌株慢,互补后生长速率没有恢复;野生菌株、突变菌株和互补菌株在过敏性反应和群体感应方面无差异。qRT-PCR分析结果显示,fliS基因缺失突变后,flh D表达量较野生菌株明显降低,fliE、fliC和flgK表达量较野生菌株明显升高,flgM和fliD表达量略微上升,fliA表达量基本不变;互补菌株中flhD、fliE和fliC表达量部分恢复,flgK、flgM和fliD表达量没有恢复,与突变菌株相同。【结论】鞭毛基因fliS对果斑病菌鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响

[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。     

固氮施氏假单胞菌RpoN蛋白对鞭毛合成的影响

选择性σ因子σ~(54)(又称为RpoN)参与到许多细菌特定基因的转录起始过程,如氮同化基因、四碳二羧酸转运基因以及鞭毛基因。为了研究施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri,A1501)中σ因子RpoN对鞭毛合成的影响,构建了A1501的rpoN缺失突变株与功能回补株,并对野生型、突变株与回补株的鞭毛结构、swimming运动、生物膜形成、根际定殖能力以及鞭毛基因的表达水平进行了比较分析。结果表明:rpo N突变株丧失了鞭毛结构与swimming运动能力,根际定殖与生物膜形成能力相对野生型分别下降了25倍与10倍;此外,rpoN缺失后A1501中大量鞭毛基因发生显著下调;启动子分析发现RpoN除了可能参与调控Ⅱ级、Ⅲ级鞭毛基因外,还可能调控一级基因fli A以及四级基因fliC。以上结果说明RpoN在不同调控等级影响A1501鞭毛的合成,进而影响该菌运动、生物膜形成、根际定殖这些与水稻建立起联合固氮体系息息相关的过程。     

STK1对玉米大斑病菌附着胞发育过程中糖原和脂肪积累的影响

【目的】通过研究STK1与附着胞发育的关系,明确附着胞发育过程中STK1对糖原和脂肪合成的调控作用,为阐明玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)附着胞发育的分子机制打下基础。【方法】以玻璃平板为疏水基质表面,通过"插片分离菌丝"法使菌丝附着于载玻平板表面,然后将附着有菌丝的玻璃平板置于保湿培养皿中22℃、14 h光照和10 h黑暗交替培养,诱导野生型菌株(WT)和STK1基因敲除突变体(ΔSTK1)的菌丝形成附着胞,每隔12 h显微观测附着胞的形态和发育过程;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板浸没在I2/KI染色液中静置染色48 h,显微观察附着胞发育过程中糖原的变化;分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板置于-70℃的超低温冰箱中冷冻处理30 min,然后将玻璃平板置于Oil-red O染色液中静置染色24 h,显微观察附着胞发育过程中脂肪的代谢变化;利用real-time PCR技术检测附着胞发育过程中糖原和脂肪合成关键酶基因的表达情况。【结果】玉米大斑病菌WT菌株和ΔSTK1菌株利用菌丝尖端在玻璃平板的疏水表面均能够产生附着胞,但ΔSTK1菌株的附着胞发育与WT菌株显著不同,WT菌株48 h内为单胞附着胞,诱导48 h后少数附着胞形成了多细胞附着胞,而ΔSTK1菌株在诱导24 h后即出现了扭曲附着胞的异形附着胞形态,48 h后还出现了双杈、多杈和O型等多种异常的附着胞类型;WT菌株和ΔSTK1菌株的菌丝和附着胞进行糖原和脂肪的染色后,发现WT菌株的菌丝和附着胞都有均匀分布的糖原和脂肪,而ΔSTK1菌株的附着胞内几乎没有糖原和脂肪的积累,与WT菌丝的结果不同,在ΔSTK1菌株的菌丝内糖原沉积减少,脂肪主要分布于菌隔部位;附着胞诱导48 h后,WT菌株糖原合酶(glycogen synthase,GS)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol O-acyltransferase,DGAT)基因的表达量比诱导前分别增加了6.6%和40.3%,而⊿STK1菌株GS基因的表达量则下降了9.0%,DGAT基因的表达量仅上升了24.5%。【结论】STK1的功能缺失使玉米大斑病菌的附着胞发育形态异常,糖原积累下降,脂肪分布不均,糖原和脂肪合成的关键酶基因表达量均显著下降,表明糖原和脂肪代谢与玉米大斑病菌的附着胞发育密切相关。     

苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及功能分析

【目的】明确衔接蛋白(adaptor protein)GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能,检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式,并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1和pnl-2以及果胶酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表达,为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径中的分子机制研究打下基础。【方法】通过构建GcAP1β基因敲除载体和GcAP1β-gfp融合表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)获得Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β,并由RT-PCR和Southern杂交分析进行鉴定。以野生型菌株W16为对照,对Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β的生长速度、产孢能力、分生孢子萌发率及附着胞形成率和致病性进行测定。利用生物信息学软件Prot Comp 9.0和TMHMM对GcAP1β蛋白进行结构分析,并结合GcAP1β-GFP信号观测,进行GcAP1β的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术,检测GcAP1β在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染阶段的表达量,并检测CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突变体中的表达量。【结果】GcAP1β基因全长2 321bp,含有3个内含子,编码720个氨基酸。与野生型菌株W16相比,Δgcap1β突变体菌落成褶皱状,菌丝生长速度明显减慢,而分生孢子产量、分生孢子萌发率、附着胞形成率无显著差异。Δgcap1β致病力明显降低,仅在苹果叶片上引起极小的点状斑。GcAP1β基因恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修复了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。荧光检测显示,融合蛋白GcAP1β-GFP分布于细胞质中。qRT-PCR检测结果表明,GcAP1β在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达,且在侵染后表达量相对最高。GcAP1β的缺失导致CgPG1表达量降低至20.3%,CgPG2表达量降低至16.5%,pnl-1表达量降低至8.2%,pnl-2表达量降低至14.4%,pelA表达量降低至4.4%,pelB表达量降至0.8%。【结论】衔接蛋白GcAP1复合体分布于细胞质中,是苹果炭疽叶枯病菌生长发育所需要的;GcAP1调控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表达,是苹果炭疽叶枯病菌一个重要的毒力因子。     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。     

黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较

为了鉴定ste20-like基因在黄曲霉生长、分生孢子形成、菌核形成中的作用以及其侵染性,并比较其与ste20基因功能的差异,以A.flavus NRRL3357为研究对象,对两个基因进行相似度比对和生物信息学分析,根据同源重组策略获得单基因缺失菌株Δste20、Δste20-like和双基因缺失菌株Δdouble（Δste20-like&ste20）,并分析基因敲除对菌株生长、分生孢子形成、菌核形成、黄曲霉毒素B₁（AFB₁）生物合成和侵染功能的影响。应用pyrG的双向遗传筛选成功获得Δste20、Δste20-like和Δdouble;与野生型相比,单基因缺失和双基因缺失突变株的生长速率、分生孢子量、菌核数量以及侵染能力都显著降低,在毒素合成方面,Δste20、Δste20-like和Δdouble菌株分别降低约76%、93%和72%;突变株之间比较发现,ste20-like缺失对生长速率的影响大于ste20基因;突变株之间的分生孢子产生量无显著差异;Δste20无菌核产生而Δste20-like还有少量菌核产生;Δste20-like菌株产生的毒素显著低于Δste20和Δdouble菌株。ste20-like基因正调控黄曲霉生长、分生孢子生成、菌核形成、AFB₁生物合成,并影响黄曲霉分生孢子对粮油种子的侵染能力。与ste20基因功能相比,ste20-like基因在调控黄曲霉生长、毒素合成方面对菌株的影响方面较显著,而在菌核形成方面ste20的基因调控作用更显著。     

福氏志贺菌mdoC基因对其在洗菜水中生长及生物膜形成的影响

【目的】研究福氏志贺菌mdoC基因对细菌在不同洗菜水中生长及生物膜形成的影响。【方法】以福氏志贺菌野生型和敲除mdoC基因的opgC突变体为出发菌株,采用生长曲线法和结晶紫染色法,在低渗透压及正常渗透压的菠菜、芹菜、生菜及白菜洗菜水中,研究福氏志贺菌野生型和opgC突变体生长及生物膜的产生能力。【结果】在不同洗菜水中,福氏志贺菌opgC突变体生长速率明显较野生型慢,加盐提高渗透压之后,野生型和opgC突变体稳定生长期均提前。野生型和opgC突变体的生物膜产量在菠菜水、生菜水和白菜水中有显著区别;提高渗透压之后,福氏志贺菌野生型在菠菜水中的生物膜产量显著提高,而在生菜水和白菜水中生物膜产量显著下降,opgC突变体在菠菜水、生菜水和白菜水中生物膜产量均显著提高。【结论】低渗条件下,福氏志贺菌mdoC基因的缺失显著地延缓了细菌生长。提高渗透压后,在菠菜、生菜和白菜洗菜水中,mdoC基因的缺失促进了生物膜的形成。     

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。     

水稻黄绿叶突变体ygl13的鉴定及候选基因分析

【目的】对水稻黄绿叶突变体ygl13 (yellow-green leaf 13 )进行表型鉴定和候选基因检测,以便了解水稻叶色形成和调控的分子机制。【方法】经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻恢复系缙恢10号（Jinhui 10）,从中筛选出1份遗传稳定的黄绿叶突变体命名为ygl13,对突变体的表型进行系统观察,调查其成熟期的主要农艺性状,分别测定野生型和突变体苗期和孕穗期的叶片光合色素含量,同时利用透射电镜观察野生型和突变体ygl13的叶肉细胞及叶绿体结构。将表型正常的不育系西农1A与突变体ygl13杂交,根据F₁和F₂群体的性状表现与分离情况,分析该突变性状的遗传行为,并以F₂作为基因定位群体,对突变体ygl13进行候选基因遴选和突变位点测序验证。【结果】突变体ygl13的植株叶片在整个生育期均呈现黄绿色,与野生型缙恢10号相比,突变体ygl13苗期和孕穗期叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均极显著降低。透射电镜观察结果显示,与野生型相比,突变体ygl13叶绿体结构异常,基质片层减少退化,类囊体片层减少,不规则的散乱分布。农艺性状调查结果表明,突变体ygl13穗总粒数增加了26.06%,株高和结实率分别降低了12.33%和18.82%,但穗长、有效穗、穗实粒数和千粒重无显著差异。F₂群体正常叶色的植株数与黄绿叶植株数分离比经χ²测验符合3﹕1分离比例（χ²=2.35＜χ²_0.05=3.84）,表明ygl13的黄绿叶性状由1对隐性核基因控制。YGL13被定位于第8染色体短臂InDel标记ID43和ID69之间,遗传距离分别为4.0和0.5 cM,区间物理距离约为318 kb,共有52个基因。经测序比对分析发现,ygl13突变体在OsSIG1编码区的第1 005个碱基G突变为碱基A（位于第三外显子）,造成编码色氨酸（Trp或W）的密码子突变为终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,则该基因编码520个氨基酸的蛋白质突变为334个氨基酸的截短蛋白。qRT-PCR结果表明,突变体ygl13部分光合色素代谢途径和光系统相关基因表达紊乱。【结论】水稻突变体ygl13的黄绿叶性状由1对隐性核基因控制,该基因与已报道的水稻质体σ因子OsSIG1为等位基因。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。