青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

云南红豆杉内生菌的分离及拮抗植物病害菌的筛选

[目的]为从与红豆杉共生的内生菌或其代谢物中寻找其他新型防治植物病虫害药物提供基础依据。[方法]以云南红豆杉为试验材料,从其根、茎、叶中分离内生菌;以棉花枯萎病、小麦赤霉病、番茄叶霉病等11种病原真菌作为供试菌株,研究红豆杉内生菌的抗菌活性,从中筛选出有较高抗菌活性的内生菌。[结果]从云南红豆杉根、茎、叶中分离出内生菌152株,其中细菌80株,真菌48株,放线菌24株;从中筛选出了有较高抗菌活性的11株内生细菌、5株内生放线菌和3株内生真菌,分别占分离得到的内生细菌、内生放线菌和内生真菌总数的13．75％、37．50％和20．83％。[结论]云南红豆杉组织内存在丰富的内生菌,不同组织内生菌的数量、种类有一定差异,在具有抑菌活性的菌物中,放线菌占的比例最高。     

艾叶内生放线菌的分离、系统发育及相关特性研究

从艾叶药用植物中共分离得到19株内生放线菌,对这些菌株分泌胞外淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶特性以及拮抗农作物病原菌和人类病原菌活性进行了研究,并对部分活性菌株进行了16SrDNA系统发育分析。结果表明:在这19株内生放线菌中,具有产胞外淀粉酶活性的菌株11株,产蛋白酶活性的菌株11株,产纤维素酶活性的菌株8株;拮抗活性试验显示,有2株菌对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)、水稻胡麻斑病菌[Bipolaris oryzae(Breda deHaan)Shoem]和肠球菌(Enterococcus sp.)具有拮抗活性,3株菌对耐青霉素类金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)具有拮抗活性。对其中的3株菌进行了16SrDNA系统发育分析,该3株菌均属于糖霉菌属,菌株IF11、IXS和IF22均同时与Glycomyces mayteni YIM61331T、Glycomyces sambucusE71T、Glycomyces scopariae YIM56256T亲缘关系最近,序列相似性分别为98.3%、98.3%和98.1%。     

红树林植物内生菌分离鉴定及其抑菌活性研究

[目的]从红树林植物组织中分离出对动物病原菌具有广谱抑菌活性的植物内生菌。[方法]以铜绿假单胞菌、多杀性巴氏杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌4种常见的致病菌作为指示菌,采用M10和P3培养基从红树林植物根、茎、叶组织中分离内生菌,以固体琼脂打孔法筛选具有抑菌活性的菌株,提取菌株的基因组DNA,PCR扩增16S rDNA基因并测序,通过邻接法构建系统发育树。[结果]从红树林植物组织中共分离857株可培养的内生菌,有145株菌有抑菌活性,占分离菌株的16.6%。其中通过M10培养基从红树林植物叶组织分离的菌株32-5对铜绿假单胞菌、产气肠杆菌都具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径分别为38和42 mm;通过P3培养基从红树林植物茎组织分离的菌株12-4对粪肠球菌具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径为56 mm;通过M10培养基从红树林植物茎组织分离的菌株13-2对多杀性巴氏杆菌具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径为64 mm。有抑菌活性菌株分为10个属,其中芽孢杆菌属是优势菌属。[结论]该试验初步揭示红树植物根、茎、叶组织中植物内生菌的抑菌活性和多样性,为开发新型抗菌药物及应用提供理论依据。     

水稻内生联合固氮细菌的分离、种类及对水稻的促生长作用

从江苏省扬州、南通、常州和徐州等地的水稻根、茎和种内分离获得了内生细菌276个菌株.以乙炔还原法测定,其中234个菌株具有联合固氮活性,占供试菌株总数的84.8%.根据乙炔还原活性(ARA)大小,将水稻内生固氮细菌分为3类:强固氮活性EARA,＞100/μmol·(h·mL)-1]菌株,占总数的2.1%;中等固氮活性[ARA为1～100/μmol·(h·mL)-1]菌株,占总数的81.2%;弱固氮活性[ARA≤1μmol.(h·mL)-1]菌株,占总数的16.7%.5个强固氮活性菌株经转管培养20代后,其固氮能力表现稳定.经形态学和生理生化试验,固氮活性强且稳定的菌株J115和G161鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),其ARA分别为20 987.820 0和9 212.313 0/μmol·(h·mL)-1.通过菌液蘸根和喷雾接种,这2个菌株均能促进水稻幼苗的生长,水稻苗期叶绿素含量、地上部干物质量和株高分别增加6.9%～17.1%、16.7%～31.0%和15.3%～20.4%.     

虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性

采集秦巴山区野生虎杖(Polygonurn cuspidatum),选取以海藻糖、葡萄糖、淀粉等为主要营养和能源的4种培养基,经分离纯化得到47株内生放线菌.经形态学鉴定并结合16S rDNA序列分析,将6株具有较强抑菌活性的菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)2株,小单孢菌属(Micromonospora)2株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株;采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果表明,17株菌株具有不同程度的抗菌活性,占所有分离菌株的36.2%,其中6株具有较明显的抑菌活性,菌株PEA023对所有靶标菌均有较强的抑制作用,菌株PEA023和PEA032对铜绿假单胞菌具有拮抗活性.     

1株间座壳属真菌抗松材线虫的活性

筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)有致死作用的内生真菌。从苦楝(Melia azedarach)健康组织(茎、叶、果实)中分离纯化内生真菌,菌株采用摇瓶培养,发酵液和菌丝体分别用乙酸乙酯萃取制备胞外和胞内代谢产物,采用浸渍法进行杀线虫活性筛选。共计分离纯化31株内生真菌,其中菌株J352-03的发酵液对松材线虫有显著的毒杀活性,在2 mg·mL^-1质量浓度下处理48 h,菌株J352-03胞内、胞外的次生代谢产物对松材线虫校正死亡率均达到100%,LC₅₀值分别为0.46 mg·mL^-1、0.42 mg·mL^-1;对松材线虫卵的孵化抑制率分别为66.54%、76.04%,松材线虫体内三磷酸腺苷酶(ATP酶)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著低于对照组。菌株J352-03经形态学与rDNA-ITS序列分析鉴定为间座壳属一未知种Diaporthe sp.。综上所述,菌株J352-03对松材线虫有良好的生防潜力,具有进一...     

刺五加内生放线菌对5种苹果病原真菌的拮抗作用初探

以苹果病原真菌尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌为靶标菌,采用皿内对峙培养法,对265株刺五加内生放线菌进行抗菌活性筛选。结果表明:供试的265株内生放线菌抗菌谱广,抗菌活性强,至少具有1种抗菌活性的菌株占菌株总数的51.0%。对层出镰刀菌和串珠镰刀菌具有抑制活性的菌株较多,分别占检测总菌株的38.9%和48.7%。对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌有抑制作用的菌株数量接近,分别占检测菌株总数的23.4%、31.7%、28.7%。对强活性菌株的PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、Helo、CYP功能基因筛选结果提示,菌株大多具有至少1种功能基因。10株强活性菌株系统发育分析表明,这些菌株都属于链霉菌属菌株。     

棉花内生拮抗枯黄萎病菌的细菌分离与筛选

采用无菌操作技术从健康棉花植株的根、茎、叶等组织中分离出内生细菌106株。内生细菌数量测定表明,棉花根、茎、叶等组织内均存在大量的内生细菌。不同生长时期内生细菌的数量不同。各组织中内生细菌的种群密度的分布特点是沿根、茎、叶递减。从棉花内生菌的分离菌株中筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株28株,对棉花黄萎病菌有体外拮抗活性的菌株47株,24株对两种病原菌都有抑菌作用,其中有些菌株表现出较强抑菌活性,具有作为生防菌的潜能。     

水黄皮内生菌的分离及其杀虫菌株的筛选

为筛选水黄皮内生菌中对水稻害虫有毒杀作用的菌株,从健康水黄皮植物的根、茎、叶和种子中进行菌株分离,并对分离出的菌株的形态、培养特征、生理生化及其他生物学特性进行研究;通过16S r DNA及ITS序列的系统发育学对其分析和鉴定。结果表明:用玻片浸渍法和喷雾法筛选出杀虫活性物质菌株,共获得细菌88株、放线菌12株、真菌3株。经初筛及复筛,内生菌麦角菌[Clavicepspurpurea(St F1)]和蜡样芽胞杆菌[Bacillus cereus(Se B3)]的发酵液粗提物分别对稻飞虱(Rice planthopper)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)致死率达85%以上。水黄皮内生菌株Se B3和St F1的粗提代谢物对稻纵卷叶螟和稻飞虱有明显地毒杀作用,为开发新的生物源农药提供了可能的生物质。     

蜡蚧轮枝菌Km9803代谢产物对蚜虫的毒杀作用

采用生物活性跟踪法测定了菌株代号为Km9803的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)在固、液两种培养基代谢产物的不同溶剂提取物及其不同馏分的杀蚜活性.结果表明,Km9803的固体培养基的乙酸乙酯提取物杀虫活性最高,对甘蓝蚜和烟蚜LC50分别达到1349.6和746.4 mg/L.该提取物经硅胶柱层析分离,洗出液合并后收集到12个馏分.测定各馏分对甘蓝蚜的活性,结果表明活性段主要集中在馏分F3,该馏分对甘蓝蚜的毒力LC50为70.57 mg/L.     

虫生真菌座壳孢代谢产物杀虫活性

从采自福建建瓯柑橘园的粉虱虫尸上分离纯化获得一株座壳孢Jos009,经液体和固体发酵培养,分别提取得到不同的代谢产物,并将其用于对桃蚜、温室白粉虱和棉铃虫3种常见害虫的防治效果研究.结果表明,该菌株液体发酵的胞外代谢产物Ⅱ对桃蚜有很强的触杀毒性,24和48h的LC50分别为1.047和0.708mg.mL-1,而该菌株代谢产物对温室白粉虱和棉铃虫无毒杀作用.本试验还发现不同的培养方式对该菌代谢产物的生物活性有很大影响,液体发酵比固体发酵更有利于其杀虫活性物质的产生.     

生防菌长枝木霉菌株T6及其代谢产物对立枯丝核菌拮抗作用

为了开发对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）具有较好拮抗作用的生防制剂,采用对峙培养法、含药培养基法和显微观察法,测定生防菌长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum）菌株T6及其代谢产物对立枯丝核菌的抑制作用活性,初步探究长枝木霉菌株T6的作用机制。结果表明,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌生长具有显著的抑制作用,对峙培养5 d时菌株T6不仅对立枯丝核菌营养生长抑制率为66.50%,而且对其菌丝具有明显重寄生作用。菌株T6发酵液及其代谢产物对立枯丝核菌营养生长也具有显著的抑制效果,培养4 d时其对立枯丝核菌的生长抑制率分别为72.29%和71.91%。因此,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌具有显著的拮抗作用,主要通过对病原菌的重寄生作用及其代谢产物发挥拮抗作用。     

3种植物次生代谢物质对舞毒蛾的杀虫活性分析

为探究苦参碱、氧化苦参碱和山奈酚对舞毒蛾3龄幼虫的杀虫活性以及杀虫机理,本研究通过生物测定、离体和体内酶活性实验,分析了上述3种植物次生代谢物质对舞毒蛾的杀虫效果及对其谷胱甘肽S-转移酶(GST)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和羧酸酯酶(CarE)活性的影响。实验结果表明:苦参碱、氧化苦参碱和山奈酚均对舞毒蛾3龄幼虫有良好的杀虫效果,其中苦参碱杀虫效果最强,致死中质量浓度(LC₅₀)为0.420 mg/mL;离体酶活性实验发现,3种植物次生代谢物质对舞毒蛾离体GST、AChE和CarE活性均有抑制效果,其中氧化苦参碱对GST和AChE抑制作用最强,抑制中质量浓度(IC₅₀)分别为0.928和0.717 mg/mL,而苦参碱对CarE抑制作用最强,IC₅₀为0.436 mg/mL;而体内酶活性实验结果显示,苦参碱对GST抑制作用最强,在处理后48 h,GST活性达到最低,仅为同时期对照组的39%;而氧化苦参碱对AChE和CarE抑制作用最强,在处理后72 h,AChE和CarE活性最低,分别为对照组的44%和40%。以上结果表明苦参碱、氧化苦参碱和山奈酚对舞毒蛾幼虫GST、AChE和CarE活性的抑制作用是其具有杀虫活性的原因之一。      

烟青虫高毒力白僵菌菌株筛选及其感菌后 体内保护酶活性的变化

从烟田烟青虫(Helicoverpa assulta)自然感病虫体上新分离鉴定一株球孢白僵菌Bb062,将其与已有的不同来源地和寄主的10株白僵菌(Beauveria spp.)一起,分别测定其对烟青虫3龄幼虫致病力以及烟青虫3龄幼虫感染高毒力白僵菌后体内保护酶活性的变化。结果表明,在供试的11个白僵菌菌株中,Bb062对烟青虫3龄幼虫毒力最高,10 d累计校正死亡率达91.07%,LT50(致死中时)为4.67 d,且与其他菌株差异显著。以孢子1.0×106、1.0×107和1.0×108个·m L-1悬浮液处理时,烟青虫3龄幼虫累计死亡率随菌液浓度的提高和接菌后时间的延长而增大,LC50(致死中浓度)为孢子1.82×107个·m L-1。烟青虫3龄幼虫感染球孢白僵菌后72 h,其体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均表现出先急剧升高,再急剧下降的变化过程。在所测试的菌株中,Bb062菌株对烟青虫毒力最高,且能够显著抑制其体内保护酶活性,因此,该菌株具有作为烟青虫生防菌的应用潜力。     

全二维气相色谱-飞行时间质谱分析紫藤种子提取物及其杀蚜活性研究

【目的】通过对紫藤Wisteria sinensis种子提取物的化学成分分析及杀蚜活性测定和抗氧化活性评价,为紫藤种子资源在植物源农药领域的利用提供基础。【方法】以紫藤种子提取物为材料,采用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF/MS)技术进行成分分析,以微量点滴法开展对棉蚜Aphis gossypii的触杀毒力测定,用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除法进行抗氧化活性评价。【结果】从紫藤种子石油醚提取物中检测到61种化合物,主要包括酯类、烷烃类、芳香烃类等化合物,其中相对含量大于9%的化合物有:对二甲苯(14.33%)、十一烷(11.89%)、1,4-二乙基苯(11.02%)和癸烷(9.54%)。紫藤种子提取物对棉蚜的致死中质量浓度(LC50)为193.22mg·L~(-1)(处理后24 h)。同时,紫藤种子提取物具有抗氧化活性,对DPPH的抑制中质量浓度(IC50)为4.15 g·L~(-1)。【结论】紫藤种子提取物具有较强的杀蚜活性,有望作为植物源杀蚜剂用于棉蚜的防治。     

老瓜头不同极性段的杀虫活性

研究通过溶剂提取法、萃取和蒸馏获得不同极性段的老瓜头提取物。以枣飞象、粘虫、小地老虎和山楂叶螨为试虫,采用小叶碟法和玻片浸渍法对不同活性段提取物进行杀虫活性测定并对活性提物段进行柱层析获得活性成分。结果表明,正丁醇提取物对枣飞象、粘虫和小地老虎的杀虫活性较好,胃毒处理48 h校正死亡率分别为73.4%、72.3%和68.2%,触杀处理48 h校正死亡率分别为64.8%、63.9%和42.4%。采用柱层析法对老瓜头正丁醇提取物进行分离,表明活性成分主要集中在X4组分,胃毒处理48 h,对枣飞象、粘虫和小地老虎的校正死亡率大于90%,触杀处理48 h,校正死亡率为70%～80%。研究表明老瓜头正丁醇提取物具有较好的杀虫作用,为开发老瓜头植物源杀虫剂奠定理论基础。     

八角枫内生真菌的分离鉴定及其发酵产物对松材线虫的毒杀活性

旨在筛选对松材线虫具有毒杀作用的生防真菌。通过组织分离法从八角枫茎、叶组织中共分离得到11株内生真菌,经摇瓶培养、乙酸乙酯萃取制备次生代谢产物,采用浸渍法开展内生真菌代谢产物对松材线虫的室内毒力试验,结合形态特征和ITS序列分析对活性菌株进行鉴定。结果表明,一株内生真菌（BZ-8）发酵液杀线虫活性显著,通过形态学与分子生物学均鉴定为Aspergillus japonicus,其发酵液有机相24 h和48 h的IC₅₀值分别为0.29 mg·mL^-1和0.21 mg·mL^-1,水相24 h和48 h的IC₅₀值分别为0.04 mg·mL^-1、0.02 mg·mL^-1。研究结果说明,八角枫内生真菌A.japonicus的胞外次生代谢产物对松材线虫具有显著的毒杀效果,值得进一步研究。     

芦苇黄酮提取液体外抗氧化特性研究

对水提芦苇叶总黄酮和醇提芦苇叶总黄酮的抗氧化性进行了研究,并与vC进行了比较,为芦苇叶的应用提供理论依据.结果表明:两种方法提取的总黄酮对O2-·、·OH、DPPH·及ABTS-均有很好的清除作用,对几种自由基的抑制能力由大到小依次为ABTS-自由基>DPPH·>O2-·>·()H.其中,水提和醇提黄酮液清除O2-·的能力相当,同种条件下略低于vC;两种提取液对DPPH·自由基清除率相当,在浓度小于0.12 mg/mL时低于vC,高于此浓度时大于vC;水提比醇提黄酮液对·OH清除能力强,在浓度小于0.3mg/mL时,两种提取液的清除率低于vC,高于此浓度时水提黄酮液的清除率大于vC;醇提比水提黄酮液对ABTS+的清除力较强,在同样条件下两种提取液的清除率均高于vC.     

巴东醉鱼草不同方法提取物的杀虫活性

为探讨巴东醉鱼草(Buddleja albiflora Hemsl.)的杀虫活性物质,以3龄粘虫(Mythimna separatea W.)为试虫,采用冷浸法、加热回流法、超声波法和渗漉法得到的巴东醉鱼草提取物应用小叶碟添加法进行毒力测定.结果表明:不同提取方法对茎的提取率均最低,叶的提取率最高.其中加热回流法对茎、叶、花的提取率最高,分别为5.76%、10.32%和9.29%,其次为超声波法,冷浸法最低.在浓度较大时,提取物对试虫的拒食活性较高;在浓度为相当于干样10 mg/mL时提取物对粘虫的生长发育影响较大,使试虫蜕皮不正常、最终出现畸形蛹或者是羽化不正常,其中加热回流法和超声波法的提取物效果明显.其中,叶的加热回流法提取物使试虫的56.67%由于生长发育不正常导致死亡;叶的超声波法提取物次之,为40%.