2株三尖杉内生放线菌的分离鉴定与活性研究

从三尖杉根部分离得到2株内生放线菌ECA023、ECA045,通过培养观察与16SrDNA序列分析,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)和小单孢菌属(Micromonospora)放线菌.采用滤纸片法和MTT法研究了菌株发酵液的抑菌和抗肿瘤活性,结果表明:2株内生放线菌对4种病原菌和K562肿瘤细胞株均显示出较强的抑制活性,其中ECA023对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表现出较强的拮抗作用,ECA045对K562细胞的平均抑制率达56.83％.     

宁夏干旱荒漠区苦豆子内生放线菌生态分布及抑菌活性研究

从宁夏灵武白芨滩国家级自然保护区不同土壤类型、不同优势植被的6个样区采集的健康苦豆子中,分离得到153株内生放线菌.同一植株不同组织中,内生放线菌数量以根部最多,其次为种子,叶部最少;淡灰钙土中苦豆子内生放线菌数量比风沙土中多.鉴定结果表明:苦豆子内生放线菌以链霉菌属(Stredtomvc)和诺卡氏菌属(Nocardia)较多;通过皿内对峙培养,对153株苦豆子内生放线菌进行抑菌活性测定,拮抗菌株数占总菌株数的90.2%,个别菌株抑菌带宽度达到20mm以上.     

西藏低温放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究西藏低温环境下放线菌的组成及其抑菌效果和酶活性,为放线菌新药物先导化合物和高活性酶的筛选提供资源。【方法】从西藏低温地区采集16份土样,用平板稀释法分离放线菌,经形态学和培养特征初步鉴定后得到有代表性的低温放线菌,对这些代表性菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,对其进行鉴定;采用菌丝生长速率法测定代表性低温放线菌菌株发酵液对11种农作物真菌的抑菌活性,并对其纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等活性进行测定。【结果】从16份土样中共分离到22株有代表性的低温放线菌,其在10~25℃均能生长。16S rRNA基因序列分析表明,这22株菌分布于放线菌门放线菌纲2个亚目3个科的3个属,即链霉菌亚目(Streptomycineae)链霉菌科(Streptomycetaceae)链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)伦茨氏菌属(Lentzea)和假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)拟无支酸菌属(Amycolatopsis),其中以链霉菌属最多,占分离菌的91%。在分离的22株代表性低温放线菌菌株中,27.3%的菌株有抑菌活性;40.9%的菌株具有纤维素酶活性,22.7%的菌株具有淀粉酶活性,18.2%的菌株具有蛋白酶活性。【结论】西藏低温生境中蕴藏着丰富的低温放线菌资源,其中一些菌株具有拮抗活性和酶活性。     

红树植物根内生放线菌的分离鉴定及其生理活性的评价

采集海南文昌清澜港头苑村红树林保护区的18种红树植物和3种半红树植物的根部样品,用1／10ATCC172培养基共分离到138株内生放线菌。经初步鉴定,分离到的138株内生放线菌分别属于继生菌属、小单胞菌属和链霉菌属3个属。对分离到的内生放线菌进行体外细胞毒活性和抗菌活性检测,结果表明,对肝癌SMMC-7721细胞有细胞毒活性的菌株有40株,抗MRSA活性的菌株有27株,所有测试菌株均未检测到抗白色念珠菌活性。对88株菌进行耐盐性检测,77株菌表现出耐盐或嗜盐特征,其中2株最高耐盐质量浓度ρ（NaCl）=150g·L-1,54株菌可在含有P（NaCl）=33g·L-1的培养基上生长良好。     

湛江湖光岩土壤放线菌分离与抗菌活性测定

采用6种不同的方法对湛江湖光岩地质公园的土壤进行预处理,用释稀涂布方法进行放线菌的分离．并对获得的放线菌进行形态、生理生化常规鉴定与抗菌活性测定。试验结果表明。新鲜土壤经28～30℃风干10d的预处理,能够有效地抑制细菌和真菌的生长．且有利于放线菌的分离。该法共获得23株菌落形态疑似不同的放线菌,经常规鉴定,4株菌株初步确定为诺卡氏菌属．2株菌株为小单孢菌属．17株菌株为链霉菌属。另外．有9株菌株具有抑制大肠埃氏菌活性;8株具有抑制金黄色葡萄球菌活性．获得3株菌株同时具有抑制大肠埃氏菌与抑制金黄色葡萄球菌活性。     

藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性、产酶潜力及拮抗活性,为开发利用相关资源提供参考。【方法】从藏北高寒草原盐碱地采集22份土样,用平板稀释法从中分离放线菌,进行初步的形态鉴定后得到有代表性的36株耐碱放线菌,对这些代表性菌株的16SrRNA基因序列进行系统发育分析,将这些菌株鉴定到属;采用生长速率法测定分离菌株发酵液对1种细菌和4种农作物真菌的抑菌活性,并对分离株菌进行纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活初筛,分析其拮抗活性。【结果】从22份土样中分离到有代表性的36株耐碱放线菌;16SrRNA基因序列分析表明,这36株菌分布于放线菌门放线菌纲5个亚目5个科的5个属,即链霉菌属(Streptomyces)、糖丝菌属(Saccharothrix)、小单孢菌属(Micromonospora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和韩国生工菌属(Kribbella);分离菌株中25.0%具有纤维素酶活性,8.3%具有淀粉酶活性,16.6%具有蛋白酶活性。所得耐碱放线菌中33.3%的菌株有抑菌活性,其中有5株具有高拮抗活性(抑菌圈直径≥20mm),分别是J10、J14、J21、J48和J65。【结论】藏北高寒草原盐碱地生境蕴藏着丰富的耐碱放线菌资源,这些耐碱放线菌具有高酶和拮抗菌活性。     

臭椿内生放线菌分离与抑菌活性检测

【目的】从臭椿中分离内生放线菌,测试其代谢产物的体外抑菌活性。【方法】采用4种培养基分离臭椿组织中的内生放线菌,采用琼脂移块法和平板对峙法研究臭椿内生放线菌的抑菌活性,通过形态特征和16S rRNA序列分析对高活性菌株进行菌种鉴定。【结果】4种培养基中以HV培养基分离效果最为理想;从臭椿组织中共分离纯化获得45株内生放线菌,有26株菌株对指示菌表现出不同程度的抗菌活性,占总分离菌株的57.78%;其中,菌株AAA19对6种供试菌株均有抑制能力,拮抗作用最强,菌种鉴定结果表明该内生放线菌为抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)。【结论】臭椿内生放线菌具有抗菌作用,菌株AAA19具有潜在的开发应用价值。     

缬草内生菌和根际放线菌的分离及安莎类抗生素的筛选

【目的】分离缬草内生菌及根际放线菌,筛选其中含安莎霉素类抗生素生物合成基因的菌株,挖掘其活性次级代谢产物资源。【方法】从缬草根、茎、叶及根际土壤中分离内生菌和根际放线菌,检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、核桃溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的抑菌效果。设计2种简并引物,用PCR方法从抑菌效果较好的菌株中筛选含安莎霉素类抗生素基因(AHBA)的菌株。分析目标菌株的最佳发酵培养基和最适发酵时长,对发酵分离物进行HPLC和质谱分析,检测其可能的次级代谢产物。【结果】试验共分离到145株菌,其中内生菌27株,占总菌株数的18.6%,根际放线菌118株,占总菌株数的81.4%;33株对病原菌有较好的抑菌效果,占总菌株数的22.8%。筛选到1株含AHBA基因的菌株AJ21,初步鉴定其为链霉菌。菌株AJ21最佳发酵培养基为SPY培养基,最佳发酵时间为6d。菌株AJ21发酵液经分离纯化、HPLC检测和质谱分析,初步确定其含有的安莎霉素类抗生素为放线菌素D。【结论】药用植物缬草内部及根际蕴含丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。     

新疆13种荒漠植物根内生放线菌多样性及其抗菌活性筛选

以荒漠植物骆驼刺、铃铛刺、碱蓬、盐穗木、柽柳等13种植物的根为材料,利用SCA培养基分离其内生放线菌,通过菌株16S rRNA基因测序,分析荒漠植物内生放线菌物种多样性。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌为靶标,通过琼脂扩散法和平板对峙法开展抗菌活性筛选。从13种荒漠植物分离出533株内生放线菌,鉴定的361株,分布于6个目,7个科,9个属,77个种,另有3个潜在新种,其中链霉菌属为优势类群,冢村氏菌属与伦茨菌属首次从植物中分离得到。研究表明13种荒漠植物内生放线菌多样性有明显差异,骆驼刺内生放线菌最丰富,分离到6个属27个种,链霉菌属有20个种;老鹳草分离到的菌株数量最多,有3个属;铃铛刺分离到2个属,其中的链霉菌属有28个种;猪毛菜、盐穗木等植物只分离到链霉菌属。抗菌活性筛选显示80株放线菌有抗菌活性,其中链霉菌74株,拟无枝酸菌3株,拟诺卡氏菌、糖霉菌和链孢囊菌各1株。本研究为寻找新型抗菌活性化合物,为生物医药和生物肥料提供菌株来源。     

海绵放线菌的分离与抑菌活性筛选研究

本文用5种分离培养基从大连海域潮间带采集的2种海绵中分离培养放线菌,以副溶血弧菌、哈维弧菌和鳗弧菌3种海水养殖病原菌为指示菌对放线菌进行抑菌活性的筛选,并基于16S rDNA序列对筛选出的抑菌活性较强的海绵放线菌进行多样性分析。结果表明:从海绵中共分离出57株海绵放线菌,以寡营养的M2培养基分离效果最好。抑菌活性筛选有55株对3株指示菌中的至少1株具有抑菌活性;有11株抑菌活性较强,对3株指示菌均具有抑菌活性,初步鉴定均属于链霉菌属。由此表明,海绵放线菌多能够产生对海水养殖病原菌较强的抑菌活性,是天然活性物质的重要来源,在海水养殖应用方面具有较大的开发价值。     

鳗鲡肠道中嗜水气单胞菌的拮抗菌筛选

从鳗鲡肠道中分离到643株细菌,用点种法筛选出65株病原性嗜水气单胞菌的拮抗菌,研究拮抗效果最好的14株拮抗菌的抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用.研究结果显示：NAC琼脂培养基筛选的2株拮抗菌（Na3-38和Nb3-15）对7株指示菌均有较强的拮抗作用,Aa3-22和Mb3-7对7株指示菌中的5株有拮抗效果;除Na3-38和Nb3-15以外,其余12株的生长系数均大于嗜水气单胞菌;11株拮抗菌（Na3-38、Nb3-15、Ab2-55、Ab2-77、Ab1-3、Aa3-22、Aa3-67、Mb1-4、Mb2-10、Mb3-7和Mb3-27）和嗜水气单胞菌的共凝集率大于10%.这表明：Aa3-22和Mb3-7在抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用都适合作为益生菌.     

魔芋软腐病拮抗放线菌的筛选及其抑菌活性研究

[目的]从土壤中分离筛选魔芋软腐病拮抗放线菌,测定其发酵抑菌活性,并对其活性成分进行初步分离。[方法]采用平板对峙培养法筛选出魔芋软腐病拮抗放线菌。对活性较强的拮抗菌株SJK18作不同碳源、氮源、温度及pH值等培养条件的单因素试验,并分别测定其发酵液的抑菌活性。分别用乙醇和乙酸乙酯萃取拮抗菌的发酵液,并测定抑菌活性。[结果]共分离得到112株放线菌,其中11株具有抑菌能力。在以玉米粉为碳源、KNO3为氮源、温度为30℃及pH值为6.0的单因素试验条件下,SJK18发酵液的抑菌活性最强,且活性的pH值适应范围在5.5～10.0。乙醇提取物的抑菌圈直径为17.0mm。乙酸乙酯萃取浓缩液无抑菌活性,而其萃余液抑菌圈直径为20.0mm。[结论]筛选获得1株对魔芋软腐病原菌有较强拮抗作用的放线菌。     

产广谱抑菌活性物质乳酸菌的分离筛选

[目的]研究筛选可产广谱抑菌性活性物质的乳酸菌,为食品保存方法的研究提供参考。[方法]以自制泡菜为材料,用含有溴甲酚紫的BCP培养基进行初筛,用添加CaCO3的MRS培养基制备上清液,复筛得到对4种指示菌有抑制作用的菌株,再经过排除酸和过氧化氢的抑制作用,且经过热稳定性试验和活性持效期试验筛选抑菌菌株。[结果]通过初筛和复筛,得到对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌有抑制作用的菌有5株。其中菌株LP-6排除酸和过氧化氢的抑菌活性后仍具有明显的抑菌活性,且经过热稳定性试验,活性持效期试验,发现LP-6菌株的发酵上清液仍具有明显的抑菌活性。[结论]初步判断菌株LP-6产细菌素类抑菌物质,可应用于食品工业中。     

抑制马铃薯干腐病菌的活性酒糟菌筛选、鉴定及抑菌活性测定

【目的】明确来源于青稞酒糟的菌株对马铃薯干腐病病原菌的抑菌活性,为马铃薯保鲜菌剂及生防制剂的开发和利用提供科学依据。【方法】采用平板对峙法对分离自青稞酒糟的40株菌株进行抑制马铃薯干腐病病原菌（青9A-7-5、青9A-8-8、青9A-5-3和青9A-6-2）活性测定,从中筛选活性菌株并进行活性菌株稳定性评价;采用牛津杯法对活性菌株发酵液萃取物进行抑制马铃薯干腐病病原菌活性测定及稳定性评价;通过形态学、生理生化特征及分子生物学方法对活性菌株进行鉴定。【结果】通过平板对峙法从40株青稞酒糟菌株中筛选出8株（菌株JZ2c24、JZ3d09、JZ3c08、JZ2b13、JZ1-4-10、JZ1-1-1、JZ1-1-9和JZ1-4-1）对马铃薯干腐病病原菌具有较高抑菌活性的菌株,其中,菌株JZ1-1-1对病原菌青9A-7-5的抑菌活性稳定,其抑菌带缩小率为25.42%,菌株JZ1-1-9对病原菌青9A-6-2的抑菌活性稳定,其抑菌带缩小率为26.20%;在浓度为50.00 mg/mL时,菌株JZ1-1-1的发酵液水相萃取物溶液对马铃薯干腐病病原菌青9A-7-5的抑菌活性较高,其抑制中浓度（EC₅₀）为19.16 mg/mL,菌株JZ1-1-9的发酵液水相萃取物溶液对马铃薯干腐病病原菌青9A-6-2的抑菌活性较高,其EC₅₀为20.80 mg/mL,且菌株JZ1-1-1的发酵液水相萃取物溶液最稳定。结合菌落形态、生理生化特征及分子生物学鉴定结果,将菌株JZ1-1-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。【结论】来源于青稞酒糟的贝莱斯芽孢杆菌菌株JZ1-1-1具有作为马铃薯保鲜菌剂及生防菌剂的潜力。     

禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究

利用从小麦茎叶组织中分离的内生真菌,进行平板对峙试验,从中筛选出2株对禾谷丝核菌有明显抑制效果的菌株(RF5和RF6)。采用改良的真菌基因组DNA提取方法,提取内生真菌RF5和RF6的基因组DNA,运用ITS序列通用引物(ITS4、ITS5)进行扩增,分别得到约600 bp的特异条带。对PCR产物进行测序,根据序列比对分析结果,将拮抗真菌RF5和RF6分别鉴定为:肉座菌(Hypoc-reales sp.)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。进一步研究这2株拮抗真菌的抗菌活性大小,结果显示,2株真菌对病原菌都能产生明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为23 mm和19 mm;其液体发酵产物对病原菌的生长也有显著抑制作用,抑制率分别为63.3%和60.8%。     

金钮扣提取物体外抑菌活性的初步研究

[目的]研究金钮扣提取物的体外抑菌活性。[方法]采用药敏纸片扩散法及2倍稀释法测定金钮扣提取物对金黄色葡萄球菌等10种细菌的抑菌效果。[结果]①对金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、微球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾杆菌、白色葡萄球菌6种供试菌有抑制作用。②及③对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、微球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾杆菌6种供试菌有较强的抑制作用。②及④对白色葡萄球菌有较弱的抑菌作用。[结论]金钮扣不同提取物对供试菌抑菌效果不同;②的抑菌效果优于①;而③及④是主要活性成分,具有抑菌作用。     

凡纳滨对虾肠道益生菌的分离· 筛选· 鉴定

[目的]获得具有拮抗常见病原菌活性、消化酶活性且具有安全性的凡纳滨对虾肠道内源性益生菌。[方法]从健康凡纳滨对虾肠道中经过初步分离与纯化得到1 220株细菌,对分离的菌株进行拮抗试验,并对产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力进行定量和定性研究。对筛选的13株细菌进行了溶血试验和药敏试验,以评价其生物安全性。[结果]共筛选出13株抑菌活性强、产酶能力强且产酶种类多的菌株,最终确定了2株候选益生菌。菌株的16 S rDNA分子鉴定及Biolog系统鉴定结果表明,细菌3号与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei strain WW2,JN993998.1)相似性达到98%,细菌6号与乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109,KC748440.1)相似性达100%。[结论]研究结果为今后益生菌制剂的开发和应用奠定了基础。     

薄荷中内生真菌的筛选和初步研究

[目的]从薄荷中筛选出能产生活性物质的内生真菌。[方法]采用组织分离法从薄荷中分离出3株不同的内生真菌P-1、P-2、P-3,对其进行不同pH值梯度培养,运用滤纸片法和对峙培养法,研究它们的抗菌活性。[结果]3株内生真菌在pH值6.5~7.5出现生长最高峰,在pH值4.0~8.5都可以生长,酸碱适应性很强,其中P-3的适应性最强。P-1和P-2对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有较强的抑制能力,而P-3只对大肠杆菌有很微弱的抑制能力。3株内生真菌对苹果锈病病原菌、苹果白粉病病原菌、苹果落叶病病原菌都有抑制作用,其中P-1的抑制能力较强。[结论]该研究获得了具有抗菌活性的内生真菌。     

抗菌肽对辣椒青枯病菌的抗性研究

对接种青枯病菌后的转抗菌肽辣椒叶片过氧化氢(H2O2)含量、多酚氧化酶(PPO)活性进行研究。结果表明:辣椒叶片H2O2含量在接种12 h后升高,对照和转抗菌肽植株的变化趋势相近,但植株间变化幅度差异明显。转抗菌肽植株接种12 h后,PPO活性显著降低,说明转抗菌肽辣椒的对青枯病菌的抗性增强。     

重组人溶菌酶体外抑菌活性研究

以购买商品化的溶菌酶标准品作为对照,通过平板扩散法检测重组人溶菌酶(rhLYZ)在体外对几株致病菌及益生菌的抑菌作用,同时用梯度稀释法检测重组人溶菌酶的MIC和MBC。分别将重组酶和商品酶做梯度稀释后,滴加到涂布有一定量菌液的MH平板,通过平板扩散法测量各组抑菌环直径大小,从而判定其抑菌活性。结果表明,重组人溶菌酶抑菌活性显著高于标准溶菌酶,低质量浓度的重组酶即可对致病菌的生长产生抑制和杀灭作用。rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌较为敏感,抑菌环直径达到15mm～18mm;对多杀性巴氏杆菌抑菌环直径则达到27.5mm。提示rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌及多杀性巴氏杆菌等病原菌均具有较强抑菌活性。