新疆13种荒漠植物根内生放线菌多样性及其抗菌活性筛选

以荒漠植物骆驼刺、铃铛刺、碱蓬、盐穗木、柽柳等13种植物的根为材料,利用SCA培养基分离其内生放线菌,通过菌株16S rRNA基因测序,分析荒漠植物内生放线菌物种多样性。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌为靶标,通过琼脂扩散法和平板对峙法开展抗菌活性筛选。从13种荒漠植物分离出533株内生放线菌,鉴定的361株,分布于6个目,7个科,9个属,77个种,另有3个潜在新种,其中链霉菌属为优势类群,冢村氏菌属与伦茨菌属首次从植物中分离得到。研究表明13种荒漠植物内生放线菌多样性有明显差异,骆驼刺内生放线菌最丰富,分离到6个属27个种,链霉菌属有20个种;老鹳草分离到的菌株数量最多,有3个属;铃铛刺分离到2个属,其中的链霉菌属有28个种;猪毛菜、盐穗木等植物只分离到链霉菌属。抗菌活性筛选显示80株放线菌有抗菌活性,其中链霉菌74株,拟无枝酸菌3株,拟诺卡氏菌、糖霉菌和链孢囊菌各1株。本研究为寻找新型抗菌活性化合物,为生物医药和生物肥料提供菌株来源。     

红树林植物内生菌分离鉴定及其抑菌活性研究

[目的]从红树林植物组织中分离出对动物病原菌具有广谱抑菌活性的植物内生菌。[方法]以铜绿假单胞菌、多杀性巴氏杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌4种常见的致病菌作为指示菌,采用M10和P3培养基从红树林植物根、茎、叶组织中分离内生菌,以固体琼脂打孔法筛选具有抑菌活性的菌株,提取菌株的基因组DNA,PCR扩增16S rDNA基因并测序,通过邻接法构建系统发育树。[结果]从红树林植物组织中共分离857株可培养的内生菌,有145株菌有抑菌活性,占分离菌株的16.6%。其中通过M10培养基从红树林植物叶组织分离的菌株32-5对铜绿假单胞菌、产气肠杆菌都具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径分别为38和42 mm;通过P3培养基从红树林植物茎组织分离的菌株12-4对粪肠球菌具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径为56 mm;通过M10培养基从红树林植物茎组织分离的菌株13-2对多杀性巴氏杆菌具有最强抑菌活性,其抑菌圈直径为64 mm。有抑菌活性菌株分为10个属,其中芽孢杆菌属是优势菌属。[结论]该试验初步揭示红树植物根、茎、叶组织中植物内生菌的抑菌活性和多样性,为开发新型抗菌药物及应用提供理论依据。     

海绵共附生放线菌的分离鉴定与抑菌活性分析

为了探究海南海绵共附生放线菌资源的多样性及潜在的药用价值，采用 4 种分离培养基分离海南文昌海域海绵的共附生放线菌，利用 16S rRNA序列分析对分离的放线菌进行鉴定，采用滤纸片扩散法对分离放线菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果表明，从4种海绵中共获得50株放线菌，所分离菌株归属于5 个亚目、6个科和 7 个属，包括链霉菌属、小单孢菌属、红球菌属、糖多孢菌、栖白蚁菌属、分枝杆菌属和Krasilnikoviella属，其中Krasilnikoviella为首次从海绵中分离得到，4株海洋放线菌为潜在的新物种。抗菌活性测试显示48%的分离菌株呈现抗细菌活性，24%的分离菌株呈现抗植物丝状病原真菌活性。本研究结果初步揭示了海南文昌海域海绵共附生放线菌的可培养物种多样性及其发酵产物的抑菌活性。     

虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性

采集秦巴山区野生虎杖(Polygonurn cuspidatum),选取以海藻糖、葡萄糖、淀粉等为主要营养和能源的4种培养基,经分离纯化得到47株内生放线菌.经形态学鉴定并结合16S rDNA序列分析,将6株具有较强抑菌活性的菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)2株,小单孢菌属(Micromonospora)2株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株;采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果表明,17株菌株具有不同程度的抗菌活性,占所有分离菌株的36.2%,其中6株具有较明显的抑菌活性,菌株PEA023对所有靶标菌均有较强的抑制作用,菌株PEA023和PEA032对铜绿假单胞菌具有拮抗活性.     

碱蓬根系嗜盐耐盐真菌的分离与鉴定

为分析耐盐植物碱蓬根系真菌的组成和耐盐程度,采用常规植物组织真菌分离方法对盐碱地中生长健康的碱蓬根系进行真菌分离,将分离得到的真菌在不同NaCl浓度培养基上进行培养,检测菌株的嗜盐耐盐性,并对分离得到的嗜盐耐盐真菌进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。结果显示:分离得到耐盐真菌40株,分别属于镰刀菌属(Fusarium sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、腐霉属(Pythium sp.)等,其中,棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是没有被报道过的耐盐真菌;分离得到嗜盐真菌3株,都属于聚多曲霉(Aspergillus sydowii)。结果表明,耐盐植物碱蓬中嗜盐耐盐真菌多样性丰富。     

产黄酮银杏内生菌的分离与鉴定

从健康银杏植株中分离到126株内生菌,并通过HPLC-UV检测方法筛选到8株内生菌产黄酮类物质。用察氏平板培养基分离菌株,根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率、质地、生长培养基颜色变化以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。初步鉴定结果分别属于匐柄霉、丛梗孢属、交链孢属、镰孢霉属、赤霉属、蜜孢霉、放线菌属和暗梗单孢霉属。     

稀有放线菌的选择性分离、鉴定及生物活性研究

聚乳酸(PLA)和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源可以有效提高稀有放线菌的分离效率,同时海洋环境中蕴藏着丰富的活性稀有放线菌,是发现新药的有效途径。为了筛选并鉴定海洋环境中产生活性物质的稀有放线菌,以聚乳酸和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源,配制6种分离培养基,用平板稀释法分离放线菌;并用滤纸片法和MTT法对供测菌株发酵产物进行活性筛选。结果表明:共分离出96株稀有放线菌,分属于11个属;其中,80株菌对7种靶标菌显示出一定的抗菌活性;78株菌对肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性。另外,比较了6种培养基对稀有放线菌的分离效果。从分离结果来看,最理想的是聚乳酸培养基。     

缬草内生菌和根际放线菌的分离及安莎类抗生素的筛选

【目的】分离缬草内生菌及根际放线菌,筛选其中含安莎霉素类抗生素生物合成基因的菌株,挖掘其活性次级代谢产物资源。【方法】从缬草根、茎、叶及根际土壤中分离内生菌和根际放线菌,检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、核桃溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的抑菌效果。设计2种简并引物,用PCR方法从抑菌效果较好的菌株中筛选含安莎霉素类抗生素基因(AHBA)的菌株。分析目标菌株的最佳发酵培养基和最适发酵时长,对发酵分离物进行HPLC和质谱分析,检测其可能的次级代谢产物。【结果】试验共分离到145株菌,其中内生菌27株,占总菌株数的18.6%,根际放线菌118株,占总菌株数的81.4%;33株对病原菌有较好的抑菌效果,占总菌株数的22.8%。筛选到1株含AHBA基因的菌株AJ21,初步鉴定其为链霉菌。菌株AJ21最佳发酵培养基为SPY培养基,最佳发酵时间为6d。菌株AJ21发酵液经分离纯化、HPLC检测和质谱分析,初步确定其含有的安莎霉素类抗生素为放线菌素D。【结论】药用植物缬草内部及根际蕴含丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。     

白骨壤内生细菌的多样性及其抑菌活性分析

【目的】分析红树植物白骨壤(Avicennia marina)内生细菌的多样性并检测其抗菌活性,为红树植物微生物资源的开发利用提供理论依据。【方法】以广西北部湾北仑河口红树植物白骨壤为试验材料,通过传统稀释涂布法和16S rRNA序列鉴定分析其内生细菌的多样性;通过发酵得到内生细菌中的次级代谢产物,并采用牛津杯法测试内生细菌次生代谢产物对5种病原菌的抑菌活性。【结果】从白骨壤的果实、花、根、叶和皮等部位共分离到61株内生细菌,隶属于3门4纲12目16科20属36种,其中有8株潜在新种,放线菌是白骨壤内生细菌的优势类群。各部位的内生细菌数量排序为果实花皮根=叶,果实的内生细菌共10个属,占总属数的50.00%。36株细菌至少对1种指示菌株具有抑菌活性,有4株细菌具有广谱抑菌活性,其中文昌小单胞菌YA350对枯草芽孢杆菌和扩展青霉的抑菌活性最强。【结论】从白骨壤的果实、花、皮、根和叶部位分离得到的内生细菌多样性较丰富,且部分具有广谱抑菌活性,可作为开发新型生物活性化合物的重要来源。     

中度嗜盐菌Halomonas sp. W2的分离和鉴定及其高产四氢嘧啶特性研究

[目的]从含盐环境中富集分离中度嗜盐菌,并进行菌种鉴定,分析确定与耐盐特性相关的主要相容性溶质,探索利用分离菌株合成四氢嘧啶的可行性。[方法]从盐池土中富集分离耐盐或嗜盐的乙酸降解菌,通过生理生化特性测定和16S rDNA序列的分析,将所得菌株鉴定至相应的属或种。通过摇瓶试验研究分离菌株耐盐生长的特征,从所得的菌株中提取、分析相容性溶质并测量其含量,初步分析分离菌株耐盐生长的机制。在高盐培养基中诱导嗜盐菌胞内相容性溶质的合成,然后在低渗盐溶液中测定相容性溶质的释放率,之后再将菌体转移至高渗培养基中研究相容性溶质重新合成的效率。[结果]从盐池土中成功分离到一株中度嗜盐菌W2,根据生理生化特性和16S rDNA序列比对结果,菌株W2属于Halomonas属,其16S rDNA序列与Halomonas ventosae Al12~T(AY268080)的相似性最高(99.93%)。菌株W2可耐受的NaCl质量浓度范围为25~200 g·L~(-1),其最适生长所需的NaCl质量浓度为100 g·L~(-1)。在高盐培养基中菌株W2单位质量细胞合成的四氢嘧啶产率达161 mg·g~(-1),占胞内4种相容性溶质总量的70.8%。低渗条件下导致W2菌体内四氢嘧啶释放的最适盐质量浓度为30 g·L~(-1),低渗冲击5 min以后释放率达61.2%,而转入高渗培养基中培养3 h后即可重新合成。[结论]Halomonas sp.W2是一株以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌,该菌四氢嘧啶的产率较高,而且具有高渗合成、低渗释放的功能,因而在四氢嘧啶的生物合成中具有较好的应用潜力。     

莫氏兰的组织培养

以花芽为外植体进行莫氏兰的组织培养研究.结果表明:莫氏兰化芽接种在MS+6- BA 5.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1的培养基中,40 d后可分化成原球茎或丛生芽;原球茎在MS +6-BA3.0 mg·L-1+NAA 0.3mg· L-1+φ =10％的椰子水的培养基上,增殖效果最好;小芽在1/3MS+花...     

垂花蕙兰种子无菌播种和快速繁殖

以垂花蕙兰种子为试验材料,采用种子→原球茎→完整植株的途径,研究基本培养基、植物生长调节剂、有机添加物和活性炭等关键因素对垂花蕙兰种子萌发、原球茎增殖、分化和生根等各培养阶段的影响,探讨垂花蕙兰无菌播种和快速繁殖的关键技术。结果表明,种子在1/2MS ＋ 6-BA 1.0 mg·L-1 ＋ NAA 1.0 mg·L-1 ＋ AC 0.5 g·L-1 ＋蔗糖20 g·L-1 培养中培养60 d可形成原球茎,种子萌发数可达90粒;原球茎在1/2MS ＋ 6-BA 1.0 mg·L-1 ＋ NAA 0.5 mg·L-1 ＋ KT 1.0 mg·L-1 ＋ AC 0.5 g·L-1 ＋ 蔗糖20 g·L-1 培养基上增殖效果好,增殖系数为6.8;原球茎在1/2MS ＋ 6-BA 0.5 mg·L-1 ＋ NAA 0.1 mg·L-1 ＋ AC 0.5 g·L-1 ＋ 蔗糖20 g·L-1 上培养分化效果好,分化率高达89.2%;幼苗在1/2MS ＋ IBA 1.0 mg·L-1 ＋50 g·L-1 土豆泥＋蔗糖20 g·L-1 上培养30 d可生根,生根率为94.5%,苗高可达5.6 cm。     

毛竹种子萌发和幼苗生长对铝胁迫的反应

为研究毛竹Phyllostachys pubescens耐铝性，以毛竹为材料并对照耐铝性不同的2种水稻Oryza sativa品种（敏感型IR1552和耐受型Azucena），通过不同铝浓度对毛竹及水稻种子发芽率、根长的影响，及对其幼苗根伸长量、丙二醛质量摩尔浓度和植物胁迫保护酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶的影响，来确定毛竹耐受性。结果表明，毛竹种子耐铝浓度为200 μmol·L^－1，在达到500 μmol·L^－1时，开始出现显著抑制现象，2 000 μmol·L^－1时达到半致死浓度，种子耐铝程度低于铝敏感型水稻品种IR1552；毛竹幼苗在500 μmol·L^－1浓度铝处理下，1 d即出现根伸长显著被抑制现象，且3 d后抑制加深，而敏感型IR1552则能在第3 天时恢复生长。毛竹幼苗经铝胁迫3 d后超氧化物歧化酶活性变化不显著（P = 0.1531），过氧化物酶活性变化显著（P = 0.018 0），而2个品种水稻均为极显著，且相对于水稻，在对照未加铝处理的毛竹苗根系中过氧化物酶活性和丙二醛质量摩尔浓度均较高。总而言之，毛竹耐铝程度低于水稻敏感型IR1552，在植物界中属于中等耐铝水平。图3表3参29     

碳源对山核桃体细胞胚发生和植株再生的影响

以山核桃Carya cathayensis花后10～12周的幼胚为外植体,建立体胚发生及再生体系,同时分别对山核桃胚性愈合组织和体细胞胚诱导的碳源种类和质量浓度进行了比较分析。结果表明：接种在含葡萄糖培养基中的山核桃胚性愈合组织诱导率显著高于蔗糖、海藻糖和麦芽糖,诱导率达33.3%;在培养基中添加20 g.L-1葡萄糖,胚性愈合组织诱导率最高,达50.0%,显著高于其他处理。蔗糖为山核桃体细胞胚诱导的最佳碳源种类,体细胞胚诱导率显著高于葡萄糖、海藻糖和麦芽糖,诱导率达23.3%;在培养基中添加45 g.L-1蔗糖,体细胞胚诱导率最高,达30.1%,显著高于其他处理。体胚在WPM培养基（木本植物用培养基）附加5 g.L-1蔗糖的培养基上萌发率达20%,显著高于附加0,10,15,20,25,30 g.L-1蔗糖的体胚萌发率。     

不同杀菌剂对荔枝胶孢炭疽菌的室内抑菌效果测定

采用生长速率法,在室内测定了w=10％的苯醚甲环唑、w=40％的氟硅唑、w=40％的腈菌唑和w=45％的咪鲜胺4种杀菌剂对编号为4—1—1和1—1的胶孢炭疽菌的抑菌效果。结果表明：苯醚甲环唑对4—1—1和1—1的抑菌效果均最好,其EC50分别为1．6077mg·L-1和1．6140mg·L-1;腈菌唑对4—1—1和1—1的抑菌效果均最差,其EC50分别为9．4059mg·L-1和10．5950mg·L-1。苯醚甲环唑对这2个菌株的抑菌效果分别是腈菌唑的5．9倍和6．6倍。     

香蜂花的离体保存及试管苗抗氧化酶活性的变化

以香蜂花试管苗为材料,研究不同浓度ABA和不同因素（白糖、琼脂、甘露醇、多效唑）对香蜂花试管苗离体保存的影响,并且测定试管苗在最佳培养基保存过程中抗氧化酶活性的变化．结果表明：适宜香蜂花试管苗离体保存的最佳培养基为MS＋20g·L-1白糖＋9g·L-1琼脂＋10g·L-1甘露醇＋7mg·L-1多效唑;同时发现最佳培养基与对照MS培养基中试管苗的抗氧化酶（SOD、CAT及POD）活性的变化趋势都是先上升后下降,但最佳培养基上的试管苗的酶活性要高于对照并且延迟了酶活性最高峰出现的时间．     

参薯组织培养快繁技术

以参薯的带节茎段为外植体、MS为基本培养基,研究了参薯的组织培养快速繁殖技术。结果表明,不含任何激素的MS培养基能诱导外植体的腋芽萌发,萌芽率达100％;萌发的茎段在MS＋AD80mg·L-1的培养基上增殖效果较好,50d可增殖4倍;继代培养得到的带节茎段在MS＋6-BA1．0mg·L-1＋NAA0．1mg·L-1＋AD80mg·L-1的培养基上能诱导出不定芽,将其芽点转接到MS＋80mg·L-1 AD培养基上,不定芽能抽生,且芽体健壮;不定芽在MS＋NAA0．1mg·L-1的培养基上能形成完整植株,生根率达100％;V土：V沙：V草木灰=2：2：1的混合基质移栽参薯组培苗的效果较佳,移栽存活率可达88．3％。     

土壤多重抗生素抗性放线菌的筛选及其发酵产物的初步研究

从4个不同地区土样中共分离得到20株天然无抗菌活性或抗菌活性微弱放线菌,采用链霉素(Streptomycin)、庆大霉素(Gentamycin)及利福平(Rifampicin)三重抗性法对其进行活性菌株的筛选后,17株放线菌的发酵液显示了抑菌活性,其中1号放线菌对链霉素、庆大霉素和利福平抗性分别为40、10和150 g...     

利用丛生芽增殖途径对大花蕙兰进行离体快繁

以大花蕙兰的侧芽为外植体,研究了利用丛生芽途径快速繁殖大花蕙兰的技术。结果表明：通过丛生芽增殖途径也能达到快速繁殖大花蕙兰的目的,在1／2MS＋6-BA3．5mg·L-1＋NAA0．2mg·L-1＋卡拉胶8g·L-1＋蔗糖30g·L-1＋φ=10％的椰子水（CW）或w=10％的香蕉匀浆的培养基上,丛生芽增殖较快,以40d为1个继代周期,1年最少可增殖9次,以每个培养周期增殖3．6倍计,1个芽1年可繁殖出3．69≈10万株苗;在丛生芽增殖培养过程中,会出现褐化现象,但并未对大花蕙兰丛生芽的增殖产生不良影响;添加妒=10％的CW或W=10％的香蕉匀浆有利于提高丛生芽的增值率及其生长势;试管苗在1／2MS＋NAA1．0mg·L-1＋AC1g·L-1＋卡拉胶8g·L-1＋蔗糖30g·L-1＋φ=10％的CW的培养基上生根良好,生根率为86．1％;试管苗移栽在水苔上的成活率达92．5％。     

南方红豆杉离体胚培养诱导不定芽研究

以南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei成熟胚为外植体,筛选出外植体灭菌途径,研究了基本培养基、生长调节剂等因子对其离体胚生长的影响。结果表明：最优灭菌处理为25.0 g·L^－1的次氯酸钠（NaClO）溶液真空灭菌10 min,其污染率仅为6%,出苗率可达86%;木本植物培养剂（WPM）为胚培养的最适基本培养基;细胞激动素（KT） 0.1 mg·L^－1和玉米素（ZT）1.0 mg·L^－1最有效于不定芽的诱导,不定芽为丛生芽;6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和异戊烯基腺嘌呤（2iP）诱导不定芽较少;噻苯隆（TDZ）不能诱导不定芽;以萌动种胚为外植体对不定芽的诱导优于未萌动种胚。图3表7参11