红景天内生放线菌拮抗菌株的筛选及抗药性标记

【目的】从红景天中挖掘出具有抑菌效果的内生放线菌,为植物病害的生物防治开发新的成员。【方法】从红景天根茎接合部位分离内生放线菌,并采用对峙培养法和菌丝生长速率法筛选对植物病原真菌具有拮抗活性的菌株,测定拮抗活性最强的菌株的16S rRNA基因序列和抑菌谱;同时,为了评估活性最强的菌株与杀菌剂混配使用的可能性,研究了其对常见杀菌剂的抗性。【结果】分离出的19株红景天内生放线菌中有7株具有拮抗活性,其中,Hj3的活性最强且对多数植物病原真菌具有拮抗作用,经16S rRNA基因序列比对初步鉴定为变异链霉菌(Streptomyces variabilis);Hj3在高浓度的啶酰菌胺、多抗霉素、萘啶酸和氨苄西林下均可正常生长。【结论】Hj3在防治常见植物病害方面表现出了一定的优势。     

柽柳根际土壤放线菌的分离及拮抗活性筛选

【目的】分析柽柳根际土壤放线菌物种多样性，研究其抗菌活性，为新疆主要农牧业病害的防控奠定菌种基础。【方法】选择新疆南疆地区10种柽柳根际土壤的放线菌资源，采用四种培养基，通过菌株16SrDNA测序，采用平板对峙法筛选抗菌活性。【结果】分离出294株菌株，鉴定的150株，分属于7个纲12个目16科24个属，另有9个潜在新种，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、解淀粉欧文氏菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、链格孢菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌。【结论】筛选出68株活性放线菌。柽柳根际土壤放线菌的分离丰富了微生物资源及菌种的储备。     

虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性

采集秦巴山区野生虎杖(Polygonurn cuspidatum),选取以海藻糖、葡萄糖、淀粉等为主要营养和能源的4种培养基,经分离纯化得到47株内生放线菌.经形态学鉴定并结合16S rDNA序列分析,将6株具有较强抑菌活性的菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)2株,小单孢菌属(Micromonospora)2株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株;采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果表明,17株菌株具有不同程度的抗菌活性,占所有分离菌株的36.2%,其中6株具有较明显的抑菌活性,菌株PEA023对所有靶标菌均有较强的抑制作用,菌株PEA023和PEA032对铜绿假单胞菌具有拮抗活性.     

药用植物鸦胆子内生细菌分离及其抑菌活性研究

【目的】从药用植物鸦胆子中分离对植物病原真菌具有拮抗活性的内生细菌,为新型生物杀菌剂的开发提供依据。【方法】采用组织匀浆法对鸦胆子内生细菌进行分离,通过离体和活体组织抑菌试验筛选活性菌株;根据形态特征、生理生化测定、16S rDNA序列分析和Biolog系统对筛选获得的高活性菌株进行鉴定。【结果】从鸦胆子的根、叶、茎和果实部位分别分离得到43、19、15和8株内生细菌,其中分离自根部的YGB-11菌株对柑桔绿霉病菌、香蕉煤纹病菌等7种植物病原菌的抑菌率均超过80.00%,表现出较好的抗菌特性,结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析和Biolog系统鉴定,确定YGB-11菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)。【结论】内生细菌YGB-11菌株具有抑菌谱广、抑菌活性较高等特点,具有良好的应用前景。     

大蒜内生菌的分离及拮抗菌株的筛选与鉴定

采用组织切块法和组织匀浆法对10种采集自全国不同地区的大蒜进行内生菌的分离,并用平板对峙法对分离得到的内生菌抗菌活性进行了筛选,根据形态学和16S r RNA等方法对有抗菌活性的菌株进行了鉴定。试验结果表明:从10种大蒜鳞茎中共分离得到大蒜内生菌102株,采用平板对峙法筛选出能同时抑制5种及以上植物病原真菌的菌株,再对筛选出的菌株进行16S r RNA测序鉴定菌种,去除重复的菌株后,得到19株抑菌活性较强的菌株。对19株大蒜内生菌进行一系列生理生化指标的检测,结果表明这些菌株的形态及生理生化特征均不相同。     

白骨壤内生细菌的多样性及其抑菌活性分析

【目的】分析红树植物白骨壤(Avicennia marina)内生细菌的多样性并检测其抗菌活性,为红树植物微生物资源的开发利用提供理论依据。【方法】以广西北部湾北仑河口红树植物白骨壤为试验材料,通过传统稀释涂布法和16S rRNA序列鉴定分析其内生细菌的多样性;通过发酵得到内生细菌中的次级代谢产物,并采用牛津杯法测试内生细菌次生代谢产物对5种病原菌的抑菌活性。【结果】从白骨壤的果实、花、根、叶和皮等部位共分离到61株内生细菌,隶属于3门4纲12目16科20属36种,其中有8株潜在新种,放线菌是白骨壤内生细菌的优势类群。各部位的内生细菌数量排序为果实花皮根=叶,果实的内生细菌共10个属,占总属数的50.00%。36株细菌至少对1种指示菌株具有抑菌活性,有4株细菌具有广谱抑菌活性,其中文昌小单胞菌YA350对枯草芽孢杆菌和扩展青霉的抑菌活性最强。【结论】从白骨壤的果实、花、皮、根和叶部位分离得到的内生细菌多样性较丰富,且部分具有广谱抑菌活性,可作为开发新型生物活性化合物的重要来源。     

猕猴桃溃疡病拮抗菌株筛选及田间药效试验

【目的】分离筛选拮抗猕猴桃溃疡病内生放线菌,为猕猴桃溃疡病生物防治提供依据。【方法】分离筛选猕猴桃内生放线菌,在使用管碟法进行抗生素效价测量的同时,对其中发酵液的部分内容进行测定,重点进行抑菌活性测定,以此筛选高抗性菌株。采用喷雾法和涂抹法两种方法进行田间防效试验。【结果】从采集的猕猴桃植株的枝条和叶片等组织中,分离得到37株内生放线菌,对其进行培养、分离和纯化,然后在此基础上进行拮抗实验、WN34菌株发酵液活性粗提物制备和大田试验。田间试验结果表明:采用喷雾法,WN34菌株发酵液粗提活性物在喷药28 d后,防效达到66.0%。采用涂抹法,WN34菌株发酵液粗提活性物对猕猴桃溃疡病的防治效果为78.2%。【结论】WN34菌株发酵液作为一种新型的抗猕猴桃溃疡病生物防治药剂有很好的开发潜力。     

缬草内生菌和根际放线菌的分离及安莎类抗生素的筛选

【目的】分离缬草内生菌及根际放线菌,筛选其中含安莎霉素类抗生素生物合成基因的菌株,挖掘其活性次级代谢产物资源。【方法】从缬草根、茎、叶及根际土壤中分离内生菌和根际放线菌,检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、核桃溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的抑菌效果。设计2种简并引物,用PCR方法从抑菌效果较好的菌株中筛选含安莎霉素类抗生素基因(AHBA)的菌株。分析目标菌株的最佳发酵培养基和最适发酵时长,对发酵分离物进行HPLC和质谱分析,检测其可能的次级代谢产物。【结果】试验共分离到145株菌,其中内生菌27株,占总菌株数的18.6%,根际放线菌118株,占总菌株数的81.4%;33株对病原菌有较好的抑菌效果,占总菌株数的22.8%。筛选到1株含AHBA基因的菌株AJ21,初步鉴定其为链霉菌。菌株AJ21最佳发酵培养基为SPY培养基,最佳发酵时间为6d。菌株AJ21发酵液经分离纯化、HPLC检测和质谱分析,初步确定其含有的安莎霉素类抗生素为放线菌素D。【结论】药用植物缬草内部及根际蕴含丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。     

肿节风内生真菌的分离鉴定及拮抗真菌筛选

【目的】分析药用植物肿节风的内生真菌多样性,筛选具有较强抗菌活性的菌株,为寻找新的抗菌药物资源打下基础。【方法】采用平板对峙法从肿节风的不同组织中分离出具有抗菌活性的内生真菌,结合形态特征和ITS序列对其进行种类鉴定,筛选出抗菌活性强的内生真菌菌株。【结果】从肿节风的不同组织中分离、纯化得到111株内生真菌,选择42株不同形态类型的菌株进行分子鉴定,分属于9目20属28种。筛选出抗菌活性强的RJ-1和JJ-1菌株[分别鉴定为橡胶生拟茎点霉菌(Phomopsis heveicola)和新壳梭孢菌(Neofusicoccum parvum)],对15种病原真菌具有较强的抑制作用,其中对三七灰霉病菌(Botrytis sp.)、三七根腐病菌(Fusarium solani)、三七炭疽病菌(Colltetorrichum gloeosporioides)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichum sp.)、艾纳香褐斑病菌(Phoma sp.)、苦玄参叶斑病菌(Alternaria sp.)和肿节风炭疽病菌(Colletotrichum dematium)等7种病原菌的抑制率均在80%以上,具有强的抑菌广谱性。【结论】肿节风存在丰富的内生真菌,其中的RJ-1和JJ-1菌株对15种病原真菌具有较强的抑制作用,可作为抗菌活性菌株开展深入研究。     

香竹箐栽培型古茶树内生真菌对植物病原真菌的拮抗活性

【目的】了解香竹箐栽培古茶树内生真菌对植物病原真菌的拮抗活性。【方法】采用尖端菌丝纯化法分离内生真菌,并结合形态学和分子生物学方法对内生真菌进行鉴定,采用五点对峙培养法筛选对供试病原真菌具有拮抗活性的内生真菌菌株,对具有较强活性的菌株进行分类地位归属。【结果】从香竹箐栽培古茶树枝叶中共分离纯化出308株内生真菌,归属于61个形态型。病原真菌拮抗试验结果显示:有18株内生真菌对4种以上供试菌的抑制率大于50%,分别隶属于2门3纲10目13科14属。有13株对至少1种供试菌的抑制率大于75%,有9株对5种供试菌的抑制率均大于50%。其中,菌株Ct-BC40、Ct-BC72和Ct-LP113对5种供试菌的抑制率达80%以上,属强拮抗菌株。【结论】香竹箐栽培古茶树内生真菌中广泛分布着抑菌活性菌株,占分离菌株总数的96%以上,且抗菌活性、种属分布具有多样性。     

小枣黑疔病拮抗放线菌的筛选与发酵优化

【目的】筛选蒙自小枣黑疔病链格孢拮抗放线菌,并优化发酵条件。【方法】以小枣黑疔病链格孢为指示菌,以肾茶26株、臭灵丹17株内生放线菌和大庆油田12株土壤放线菌作为供试菌,采用滤纸片法筛选高拮抗放线菌,进而通过单因子试验优化发酵条件。【结果】筛选到一株分离自肾茶根部、抑菌带宽达13.6 mm的拮抗菌株BEG-46,其最佳培养基组成和最佳培养条件为1 000 mL培养基中含葡萄糖2 g、酵母粉20 g,蛋白胨2 g,NaCl 4 g,CaCO_34 g,初始pH值为自然,发酵温度28℃,发酵周期为7 d;优化后BEG-46发酵液抑菌活性提高了118.3%。【结论】拮抗放线菌BEG-46的发酵液抑菌活性在优化条件下显著提升。     

一株苦参内生真菌的抑菌特性及活性成分的结构鉴定

 【目的】分离药用植物苦参内生真菌,明确其抑菌特性,确定内生真菌BS001发酵产生抗菌物质的种类及结构。【方法】采用常规的组织分离法对内生真菌进行分离,平板菌块法测定抑菌特性,捷克八层析试验确定其极性,柱层析及冷冻干燥的方法对其分离纯化,并利用TLC生物自显影进行跟踪,采用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度,1H-NMR、13C-NMR以及液相色谱-质谱（LC-MS）等方法对其进行结构鉴定。【结果】从苦参种子中分离出1株内生真菌菌株,编号为BS001。该菌株对辣椒疫霉病菌、番茄炭疽病菌、油菜菌核病菌、苹果斑点落叶病菌等病原菌具有抑制效果,其中对番茄炭疽病菌的抑菌直径达2.734 cm。其发酵液经进一步分离纯化后,用波谱学技术对其抑菌活性成分进行鉴定,结果表明其结构为6,7-(2′E)dibutenyl-5,8-dihydroxy-(Z)-cyclooct- 2-ene-1,4-dione。【结论】苦参中存在1株对多种病原菌具有抑制作用的内生真菌,经鉴定为土曲霉（Aspergillus terreu）。在该菌株发酵液中得到一种新抗菌活性物质,可用于生物药物及生物农药的开发。     

匙叶翼首草内生真菌的分离鉴定及其抗菌活性

研究匙叶翼首草内生真菌的种群组成及其代谢产物的抑菌活性,获得抗菌活性较好的菌株,以寻找新型抗菌物质。采用内生菌常规分离法和3种培养基对匙叶翼首草健康植株的根、花葶、叶进行内生真菌的分离鉴定,并采用7种指示菌,用平板对峙法对分离获得的内生真菌进行抑菌活性试验。结果表明,从健康匙叶翼首草植株中共分离获得64株内生真菌;同一植株不同组织中的内生真菌数量以根最多,其次为叶,花葶最少;经形态学鉴定分属于 4目、6科、14个属,其中青霉孢属为匙叶翼首草内生真菌中的优势菌群,链格孢属、曲霉孢属、暗双孢属和无孢类群为常见属。平板对峙抑菌试验表明,有11.9%的菌株对所测试病原真菌具有抑菌活性,且抑菌活性较弱。     

檀香紫檀内生真菌多样性与抗菌活性分析

【目的】分析药源植物檀香紫檀内生真菌多样性及其代谢产物抗菌活性,为寻找新型抗菌活性物质提供参考。【方法】从广东药科大学中药园采集3株健康檀香紫檀的根、茎、叶组织样品,采用组织分离法分离其内生真菌;结合形态学和分子生物学方法对檀香紫檀内生真菌进行分类和鉴定;分别采用纸片扩散法和菌丝生长速率法研究代表性内生真菌发酵液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC44102、痢疾杆菌（Shigella dysenteriae）CMCC51252、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC50115、白色念珠菌（C.albicans）ATCC10231和黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC98003的抗菌活性。【结果】从450块檀香紫檀组织中共分离到337株内生真菌,其中来自叶172株、茎66株、根99株,隶属15个属。叶部内生真菌的相对分离率和定殖率最高,均为79.63%;叶部、根部和茎部的内生真菌多样性指数分别为1.02、0.93和0.64,三者间差异显著（P< 0.05）。木霉属（Trichoderma sp.）为根部优势属,相对分离率为28.28%;青霉属（Penicillium sp.）为茎部和叶部的优势属,相对分离率分别为46.97%和52.91%。45株代表性内生真菌发酵液抗菌活性测定结果显示,有16株内生真菌（35.56%）对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌具有抑菌活性;36株（80.00%）对白色念珠菌和黑曲霉具有抑菌活性;有15株（33.33%）对6种测试细菌和真菌均具抑制活性,其中菌株L9（Colletotrichum sp.）代谢产物的抗菌活性最好,对黑曲霉抑制活性达67.35%,对其余5种测试菌的抑菌圈直径均大于10 mm。【结论】檀香紫檀内生真菌类群分布具有一定的器官组织特异性,物种多样性较丰富,且蕴含有较高比例的抗细菌和抗真菌活性菌株,可为新型抗菌活性物质的筛选与开发提供菌株资源。     

藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究藏北高寒草原耐碱放线菌的多样性、产酶潜力及拮抗活性,为开发利用相关资源提供参考。【方法】从藏北高寒草原盐碱地采集22份土样,用平板稀释法从中分离放线菌,进行初步的形态鉴定后得到有代表性的36株耐碱放线菌,对这些代表性菌株的16SrRNA基因序列进行系统发育分析,将这些菌株鉴定到属;采用生长速率法测定分离菌株发酵液对1种细菌和4种农作物真菌的抑菌活性,并对分离株菌进行纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活初筛,分析其拮抗活性。【结果】从22份土样中分离到有代表性的36株耐碱放线菌;16SrRNA基因序列分析表明,这36株菌分布于放线菌门放线菌纲5个亚目5个科的5个属,即链霉菌属(Streptomyces)、糖丝菌属(Saccharothrix)、小单孢菌属(Micromonospora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和韩国生工菌属(Kribbella);分离菌株中25.0%具有纤维素酶活性,8.3%具有淀粉酶活性,16.6%具有蛋白酶活性。所得耐碱放线菌中33.3%的菌株有抑菌活性,其中有5株具有高拮抗活性(抑菌圈直径≥20mm),分别是J10、J14、J21、J48和J65。【结论】藏北高寒草原盐碱地生境蕴藏着丰富的耐碱放线菌资源,这些耐碱放线菌具有高酶和拮抗菌活性。     

薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性

为筛选薏苡种仁内生真菌的抗菌活性,采用组织分离法,从禾本科黍亚科蜀黍族薏苡种仁中分离内生真菌,采用菌饼法筛选其抗菌活性。通过5．8 S ITS 分子系统学鉴定菌种,高效液相色谱法（HPLC）分析鉴定菌种发酵液正丁醇提取物次的生代谢产物。结果表明：分离共获得23株薏苡种仁内生真菌,其中,有弯孢霉属、链格孢属、砖孢属、茎点霉属、灰软盘菌属、稻黑孢属、玉蜀黍赤霉属、曲霉属及其他真菌。57％的菌株至少对测试菌株中的1种具有抗菌活性,且 GZR19号菌株具有广谱抗菌活性并鉴定为1种茎点霉（Phoma sp ．）,其发酵液的次生代谢产物在该色谱条件下主要有4种物质含量较高,其中可能存在具有抗菌活性的化合物。     

新疆达坂城盐湖嗜盐细菌分离鉴定及活性分析

【目的】研究新疆盐湖嗜盐微生物资源及发掘菌株发酵液的农用和医药活性。【方法】采集达坂城区达坂城盐湖湖边的淤泥样品进行菌株分离鉴定,采用4种不同分离培养基,使用平板稀释涂布法结合16S rRNA进行分离鉴定;并用平板对峙法对分离到的放线菌进行植物病原菌拮抗活性研究,用HepG2细胞增殖测定其抑制肿瘤活性。【结果】获得细菌18株,鉴定为14个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)为优势种群。有3株放线菌具有拮抗植物病原菌活性,其中菌株Tsukamurella sinensis DBC26和Nocardiopsis crassaminis DBC31有拮抗棉花枯萎菌活性,Streptomyces longispororuberDBC5有拮抗水稻恶苗菌活性。菌株DBC5、DBC9和DBC10对HepG2细胞增殖的抑制率分别为96.4%、91.8%和87.8%。【结论】达坂城盐湖细菌在数量和种类上存在丰富的多样性,且稀有放线菌种类较为丰富,并且其发酵液具有拮抗植物病原菌活性和抑制肿瘤细胞增殖活性。     

一株抗多杀性巴氏杆菌的白花泡桐内生真菌的分离和鉴定

采用组织分离法从药用植物白花泡桐叶中分离内生真菌,以动物病源菌多杀性巴氏杆菌C48-3、C51-3和X-73为指示菌种对分离到的7株内生真菌进行了抗菌活性筛选,采用形态特性观察及ITS-rRNA序列分析对具有抗菌活性菌株JSD-8进行鉴定。抑菌试验结果显示,JSD-8菌株对多杀性巴氏杆菌C48-3、C51-3和X-73均具有较强的抗菌活性,其抑菌活性成分值得进一步研究。通过形态特性观察及ITS-rRNA序列分析,将JSD-8鉴定为串珠状赤霉菌。     

生存胁迫法分离那拉提土壤拮抗放线菌及活性产物

【目的】通过"生存胁迫法"分离拮抗活性放线菌,为提供潜在抗菌活性菌株奠定基础。【方法】将7株病原菌与那拉提土壤共孵育30天后,采用"生存胁迫法"和"96孔板法"分离新疆那拉提土壤活性放线菌,结合HPLC法分析拮抗菌株次生代谢能力。【结果】最终分离获得29株放线菌中26株具有活性,拮抗活性放线菌比例高达89. 7%。对同时具有三种指示菌抑制活性的链霉菌——TRM70003进行次生代谢产物挖掘,成功获得了放线菌素D和星形孢菌素。【结论】本研究表明,"生存胁迫法"和96孔板相结合是分离获得产抗能力较强放线菌的有效方法。     

小檗内生放线菌H21的鉴定及抑菌活性成分分析

【目的】从药用植物小檗（Berberis thunbergii）中筛选抗菌活性内生放线菌,对活性菌株的分类地位及抑菌活性进行研究,分离并鉴定候选菌株发酵液中活性成分的化学结构及其抑菌活性,为农用杀菌剂的创制提供依据。【方法】采用选择性培养基从小檗叶片分离内生放线菌,16S rDNA法进行菌株鉴定;采用管碟法测定发酵液对烟草青枯病菌 （Ralstonia solanacearum）等7种供试菌的抗细菌活性,采用抑制菌丝生长速率法测定发酵液对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等7种植物致病菌的抗真菌活性;依次采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及反相高效液相色谱（HPLC）等技术分离纯化活性组分;采用核磁共振波谱（NMR）和质谱（MS）技术对分离到的活性成分进行结构鉴定;采用微量肉汤稀释法测定化合物对烟草青枯病菌等7种细菌的最低抑菌浓度,抑制孢子萌发法和菌丝生长速率法测定化合物对番茄灰霉病菌的抗菌活性。【结果】分离到一株活性菌株H21,该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为链霉菌（Streptomyces sp.）;除铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外,H21菌株发酵液对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等多种病原细菌有明显的抑菌活性;H21发酵液对番茄灰霉病菌表现出较强的抑制菌丝生长作用,对其他供试病原真菌无明显的抑菌活性;从H21菌株发酵液中分离鉴定了3个化合物,分别为N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺、环-（L-亮氨酸-L-精氨酸）和二硫吡咯类抗生素-全霉素;全霉素为广谱抗生素,其对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.156、0.313、0.078、0.313、0.156和0.313 µg·mL^-1;对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑菌中浓度（IC₅₀）分别为13.56和7.89 µg·mL^-1。【结论】小檗内生菌放线菌H21可能是一种新的全霉素产生菌,其对植物致病细菌烟草青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌有抗菌活性,全霉素对于开发针对致病细菌的农用杀菌剂具有重要的参考价值。