猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)核衣壳蛋白的克隆、表达与免疫印迹

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N蛋白)基因克隆到原核表达载体pET-28α( )中,得到重组质粒pET-PRRSV/N,并转化入受体菌BL21中.转化子经IPTG诱导表达4 h后,表达蛋白量达到高峰.经15%SDS-PAGE电泳检测和经Western blotting分析,表达蛋白大小约为17 kD,符合预期结果,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,而不与阴性血清反应.这说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性.     

PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法的建立

用亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400 ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D_(490 nm)≥0．43D_(po■) 0．57D_(neg)判为阳性,反之判为阴性。对采自14个猪场的364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为51．4%,略高于HerdChek ELISA的阳性检出率49．7%。与HerdChek ELISA相比,间接ELISA的敏感性为94．5%,特异性为91．3%,总符合率为92．9%,Youden指数为0．86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性,并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。该方法的成功建立将为我国PRRS的防制工作作出贡献。     

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体间接ELISA方法的建立

采用纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒重组核衣壳蛋白作为ELISA试验的标准抗原,通过优化ELISA各种条件,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该方法具有良好的特异性和重复性。     

PRRS病毒核衣壳蛋白基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物，用RT—PCR扩增出美洲型PRRSV的核衣完蛋白(N)基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，再亚克隆到表达载体pGEX—6p—1谷既甘肽—S—转移酶(GST)基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG于37℃条件下诱导，经SDS—PAGE和Western blotting分析，GST—N融合蛋白的分子质量约为39．5ku，另3种不同大小的GST—N降解产物，分子质量分别为33．0、30．5和27．5ku，其中39．5和30．5ku的降解产物分别占菌体蛋白的30．9％和15．3％。结果表明：PRRSV核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式得到高效表达，且表达产物能与PRRSV抗体阳性的猪血清发生特异性反应，可作为PRRS诊断抗原。     

类NADC30毒株致猪繁殖与呼吸综合征的诊断

通过临床症状观察、病理学检测、RT-PCR检测与序列分析等方法,对疑似患猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病猪进行诊断。送检病猪临床表现发热、呼吸困难、皮肤发绀;剖检病变为肺脏实变、淋巴结肿大出血;组织学变化主要包括间质性肺炎、淋巴结出血及多核巨细胞浸润;免疫组化结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗原主要定位于肺泡上皮细胞和巨噬细胞;病料RT-PCR结果呈PRRSV(命名为SJZ201701株)阳性;序列分析结果表明,该病毒的核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白基因与NADC30株之间基因核苷酸、氨基酸的同源性最高,分别为96.3%和84.4%。遗传进化分析表明,SJZ201701株与NADC30参考毒株关系最近。综合判定该病例为类NADC30株PRRSV引起的感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长约15kb,含有8个开放的阅读框架（ORFs）。PRRSV基因组的顺序依次为：5’-ORFla-ORFlb-ORF（2—6）．ORFT-3’。鲁韦韦等分析表明,PRRSV的ORF7基因保守性较好,变异较小。此外,ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性,机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。因此,N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。     

猪细环病毒1型感染与猪繁殖与呼吸综合征的相关性分析

[目的]分析猪细环病毒1型(TTSuVl)感染与猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)的发生是否存在相关性.[方法]采集40头临床疑似PRRS病猪血清和40头同群健康猪血清,确认PRRS病猪与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)亚临床感染猪,用荧光定量PCR方法检测TTSuV1和PRRSV载量,进行差异比较和相关性分析.[结果]常规PCR结合荧光定量PCR检测确认有31头PRRS病猪和27头PPRSV亚临床感染猪,前者PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于后者;虽然PRRS病猪的TTSuV1载量高于PRRSV亚临床感染猪,但其差异不显著.PRRSV感染猪的血清中的TTSuV1载量与PRRSV载量之间无显著(P＞0.05)相关性.[结论]TTSuV1感染与PRRS发生之间可能没有相关性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)方法的建立和应用

目前,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为全球范围内影响较广的猪类重要疾病之一,因此建立快速、有效的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术成为预防和控制PRRS传播的关键。在序列分析的基础上,设计特异性引物,建立基于熔解曲线分析的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法。该方法能够特异性扩增PRRSV,并用经熔解曲线分析产生特异性的熔解峰,而非靶标病毒未产生非特异性扩增;PRRSV的检测灵敏度可达50 copies/μL;批内、批间重复试验中变异系数均在2%以内;对118份临床样品进行检测,阳性率为31.4%,与普通PCR检测结果相符率为100%。结果表明,建立的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法具有较高的特异性、灵敏度和良好的重复性,可用于临床PRRSV感染的早期诊断及分子流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗与LT蛋白配伍经黏膜途径接种小鼠免疫效果分析

旨在评价猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)活疫苗与大肠杆菌热敏性肠毒素(LT)蛋白配伍后经滴鼻途径接种小鼠后的免疫应答水平,分析猪繁殖与呼吸综合征活疫苗经黏膜途径免疫的可行性。试验共分为四组,分别为对照组、PRRSV滴鼻组、PRRSV+LT滴鼻组和PRRSV注射组。一免、二免后检测血清Ig G和鼻拭子Ig A抗体水平,同时检测IFN-γ和IL-10细胞因子的表达。结果表明:二免后,PRRSV+LT滴鼻组可产生较高水平的Ig G抗体,与PRRSV注射组无显著差异; PRRSV+LT滴鼻组产生的Ig A抗体水平明显高于PRRSV注射组; PRRSV+LT滴鼻组小鼠脾脏IFN-γ、IL-10水平与PRRSV注射组无显著差异。因此,猪繁殖与呼吸综合征活疫苗与LT蛋白经滴鼻途径免疫小鼠,可产生理想的黏膜免疫应答及系统的体液免疫和细胞免疫反应。黏膜分泌性抗体的产生,为阻断病毒局部感染提供了保护屏障,能更有效达到抵抗病毒入侵及感染的目的。     

间接血凝试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

以猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒致敏猪红细胞作诊断液,用间接血凝试验（IHA）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。检测了可疑猪场80份血清样本,PRRS阳性32份,阳性率40%,与ELISA试验比较符合率98%。用此方法检测PRRS疫苗免疫猪血清,发现其抗体水平在初免后15天升高,二免后15天达最高峰,二免后45天抗体水平消失。     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.     

广西部分地市高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行病学研究

参照GenBank中已发表的PRRSV的序列设计了1对特异性引物,从广西部分地市发病猪场送检的65份病料中,检出14株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。对14个出现阳性的扩增产物进行克隆、序列测定,基因序列全长均为427bp,与国内部分流行毒株核衣壳蛋白基因的同源性均为96.2%以上,14份阳性样品之间同源性为97.2%以上,证实扩增的产物为高致病性猪繁殖与呼吸综合征。遗传进化分析表明,广西流行毒株均属于一个亚群,与江西、广州流行毒株高度同源。     

猪繁殖与呼吸综合征及其免疫防控研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种主要表现为母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病的致死性传染疾病,是严重影响世界养猪业的经济性疾病之一,对该病的预防、发病后的诊断及时处理控制是猪场面临的主要问题之一。本文综述PRRSV生物学及分子免疫学特征、PRRS的诊断、免疫防控等方面的研究进展,为PRRS的深入研究及猪场对该病的控制提供参考。     

RT-PCR检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立

通过逆转录-聚合酶链扩增(RT-PCR)反应,建立从猪粪便中检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RNA的方法,以此方法检测了2个猪场8份样本,结果显示6份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性。     

防控猪繁殖与呼吸综合征的措施

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病,可导致母猪繁殖性障碍、早产、流产、死胎、木乃伊胎及提高断奶前仔猪的死亡率,给全球养猪业造成了严重的经济损失。虽然目前没有特效药来治疗PRRS,但采取综合防控措施可有效的控制该病。文章根据PRRSV的生物特性综述了防控猪繁殖与呼吸综合征的措施。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

PRRSV经典株和变异株RT-nPCR鉴别诊断方法的建立

【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测,达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过改变不同的反应体系和反应条件,建立PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测,验证建立RT-nPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL;且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带,从CH-1R经典株扩增出649bp条带,从SXXY/2013变异株扩增出562bp条带,电泳后能清晰区别,而从其他参考毒株中均不能扩增出目的条带。从48份疑似病料组织和血清中能直接检测出31份阳性结果。【结论】建立了一种灵敏度高、特异性好、可直接从病料组织和血清中快速鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR方法。     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。