苹果茎痘病毒基因变异及重组分析

苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒,为了解ASPV的变异特点,基于已报道的ASPV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列信息,结合RNA二级结构分析,对ASPV的变异进行分析。结果显示,不同分离物CP基因前半部分区域存在3个大段的空位区。中国分离物PR1在CP基因末端有12个核苷酸的序列插入,RNA二级结构预测显示,插入点附近能形成一个稳定的茎环结构,序列插入并未引起RNA二级结构的明显变化。重组分析显示,波兰分离物ST181为中国分离物WS和波兰分离物N1的重组体,系统进化分析支持该重组事件的发生。ASPV核苷酸序列变异复杂,并能够发生重组,因而有必要收集更多抗性资源,加强抗病育种。     

茶树等木本植物炭疽菌种群遗传分化研究

从福建省不同地区茶树及其他木本植物上分离获得38株炭疽病菌,采用r DNA-ITS序列分析方法对供试菌株进行系统发育分析和种群分化研究。结果表明,炭疽菌不同种群遗传多样性丰富且存在遗传差异,供试不同寄主来源炭疽病病菌在r DNA-ITS基因序列上存在一定的特异性,但不明显。供试炭疽病病菌存在一定的寄主专化性,不具有地理来源特异性。序列比较结果显示,菌株间的ITS序列同源性较高,但仍存在多种不同类型的碱基变异,包括碱基的缺失、突变、插入等。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒山东南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

通过RT-PCR扩增得到了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus,CGMMV）山东泰安南瓜分离物（CGMMV-TANG）的外壳蛋白基因,经过序列分析,该分离物外壳蛋白（CP）基因全长486个核苷酸,由161个氨基酸组成。对CP基因核苷酸序列进行同源性比较和构建系统进化树,并结合寄主来源及地域来源进行分析,结果表明该病毒的不同分离物在分组上与地域有一定的关系。     

云南球孢白僵菌的遗传多样性研究

 球孢白僵菌是一种广谱性虫生真菌,在害虫种群的自然控制中发挥着重要作用。为弄清云南省球孢白僵菌种群的遗传多样性,丰富云南虫生真菌多样性内容,本研究采用ISSR分子标记技术对云南不同地区及不同寄主来源的39个球孢白僵菌菌株的遗传多样性进行了分析。结果表明,有11个ISSRs可用于39个球孢白僵菌菌株群体PCR扩增,每个引物扩增5～15条DNA带。供试39个球孢白僵菌菌株群体的多态位点百分率(PPL)达99.09％,不同寄主来源亚种的Nei基因多样性(He)为0.3478,居群间的基因分化系数(Gst)为0.0724,总基因多样性(Ht)为0.3518,亚种群内基因多样性(Hs)为0.3263,不同寄主亚种群间的基因流(Nm)为6.4044;不同地理来源白僵菌种群Nei基因多样性指数He为0.3444,Shannon 指数I为0.5152;总基因多样性Ht为0.3473,亚种群内基因多样性Hs为0.2131,亚种群间的基因分化系数Gst为0.3862。综合遗传多样性结果,云南省球孢白僵菌种群遗传结构复杂、遗传异质性明显,从寄主来源来看,居群间遗传变异较小,居群内遗传分化较大;从地理来源来看,居群间遗传变异较大,居群内表现遗传变异较小。     

广东省鼎湖山国家级自然保护区球孢白僵菌遗传多样性研究

【目的】了解广东省球孢白僵菌Beauveria bassiana的群体遗传结构、基因流、菌株分化、遗传变异和寄主类型,以及与生态环境的相关性,为筛选优良生产菌株提供后备种质资源。【方法】采用SSR分子标记对广东省鼎湖山国家级自然保护区(以下简称"DHS")采集的81株球孢白僵菌进行遗传结构和多样性分析。【结果】使用8对SSR引物扩增81个菌株产生多态位点数为58个,多态位点比率为100%,其中,引物Ba12多态位点数最多(10个)。通过Popgene 32软件包分析发现,DHS球孢白僵菌种群Nei’s基因多样性指数(h)为0.212 6,Shannon信息指数(I_s)为0.348 7,可见其遗传多样性水平较高,群体异质性较强。将群体分别按照寄主和土壤、不同寄主目划分为不同亚群进一步分析,发现土壤亚群遗传多样性水平(h=0.192 5,I_s=0.309 9)略高于寄主亚群(h=0.176 9,I_s=0.278 3),种群间遗传分化程度较弱(N_m=1.662 9,G_(st)=0.130 7);不同寄主目群体间的遗传分化较小且基因流明显。基于UPGMA聚类分析发现,各分支菌株的分布趋势与分离基质、不同寄主目均没有相关性。【结论】DHS球孢白僵菌遗传谱系与分离基质和寄主来源均无明显相关性,不同生态环境和寄主类型的影响共同维持了DHS球孢白僵菌种群内遗传变异的多样性。     

基于外壳蛋白核酸序列的中国黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物起源分析

以直接从中国进口源性葫芦种子中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得种子上携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(CP)基因(LHP,Liaoning cucurbits seed protein ),将其克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明该CP基因(GenBank登陆号:DQ997778)由483个核苷酸组成,编码161个氨基酸.对包括该分离物在内的19个CP基因核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合寄主来源及地域来源进行LHP的起源分析,结果表明黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物的序列分群和进化关系与上述两个因素无明显关系.     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析及其分组

为了揭示黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)河北分离物分子变异及系统进化情况。本研究自河北省5个代表性西瓜产区采集病样,分离纯化获得5个CGMMV河北分离物,经RTPCR扩增、基因克隆获各分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列。使用Vector NTI 10.0软件(Informax,Frederick,MD,USA)和MEGA5.0软件(Koichiro,Tokyo,Japan)对河北省5个分离物及GenBank已登录其它分离物CP进行序列分析,构建系统发育树。系统进化关系分析表明:所有CGMMV分离物可划分为5个组,CGMMV河北分离物与中、日、韩三国分离物亲缘关系较近,位于同一组别。与希腊2个分离物(CGMMV-GR5、GR3)亲缘关系最远。CGMMV CP序列相似性分析结果表明:河北省5个分离物CP核苷酸、氨基酸序列相似性在99%~100%之间,与其它17个分离物序列相似性在92%~100%之间。与中国LN及Liaoning两个分离物及韩国Watermelon分离物相似性最高为100%,与希腊2个分离物(GR5、GR3)序列相似性最低为92%~99%。揭示了CGMMV河北分离物的分类地位及其与不同来源分离物之间的遗传进化关系,为进一步研究CGMMV株系划分、基因遗传变异提供了理论基础。     

美洲斑潜蝇不同寄主种群及地理种群间的β-tubulin基因序列分析

 【目的】通过对美洲斑潜蝇β-tubulin基因序列的比较,分析不同寄主种群和地理种群的遗传分化情况。【方法】对中国美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard 5个寄主种群以及6个地理种群的β-微管蛋白基因（β-tubulin gene）进行测序,运用软件DNAStar和MEGA对美洲斑潜蝇不同地理种群及寄主种群的β-tubulin基因序列的遗传分歧及相似性进行分析,并建立系统发生树。【结果】DNAStar和MEGA两种软件对美洲斑潜蝇不同寄主种群以及地理种群间的遗传关系的分析可得到相似的结果。在美洲斑潜蝇寄主种群和地理种群序列变异分析中,共发现8个变异位点,序列长度比较保守,均没有碱基的插入或缺失。美洲斑潜蝇不同寄主种群之间以及地理种群之间的β-tubulin基因序列相似性极高,都在98%以上。【结论】虽然基于β-tubulin基因序列所显示的美洲斑潜蝇各寄主种群之间以及地理种群之间的遗传分化很小,但是其分化趋势分别与对寄主的嗜好程度以及地理分布基本吻合。     

云南葡萄炭疽病菌遗传多样性分析

本研究利用β-tub2,ef1-α和his4基因部分序列对60株采自云南省不同葡萄产区的葡萄炭疽病菌菌株进行基因谱系分析。结果表明:引起云南葡萄炭疽病的病原菌种类较为复杂,不仅包括胶孢炭疽菌复合种群中的Colletotrichum gloeosporioides,还有胶孢炭疽菌复合种群中的其他种或炭疽菌属其他种。来源于不同产地不同葡萄品种上的炭疽菌遗传多样性丰富,但分子水平的多样性与菌株的地理来源、寄主种类、形态特征及对红提致病力方面无明显相关性。     

山西草莓斑驳病毒cp基因克隆及遗传多样性分析

旨在研究草莓斑驳病毒（SMoV）在山西省的分布、结构变异及遗传多样性。从山西省7个主要草莓种植区随机采取159份草莓叶片进行RT-PCR病毒检测，结合在线数据库，使用MEGA5构建系统发育树，采用SDTv 1.2软件进行序列相似性分析，运用DnaSP v5.10软件分析cp基因的遗传多样性，采用RDP v.4.31 软件检测SMoV中的重组事件。RT-PCR检测后发现，从山西省各地区收集的159份草莓叶片中有65份样品呈阳性，检出率为38.46%。这些阳性样品经过分离、测序、克隆，获得16个SMoV分离物。结合在线的19个SMoV分离物系统进化树分析显示，35个SMoV分离物被分成两组，组1包含28个分离物，均来自中国；组2包含7个分离物，分别来自加拿大、日本和美国。经选择压分析和中性检验，组1和组2 SMoV分离物之间存在显著的遗传差异，且中性检验均为负值，SMoV种群呈扩张状态。序列相似性分析表明，35株分离物的核苷酸同一性为81.34%~100%，氨基酸的一致性为94.77%~100%，呈现出较高的相似性。可见：SMoV存在较高的遗传变异，负选择压力可能是导致SMoV遗传多样性的原因。     

苹果茎痘病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的原核表达

[目的]苹果茎痘病毒为潜隐性病毒,该病毒寄主范围和分布广泛,能侵染多种果树.目前侵染新疆库尔勒香梨,造成了严重的经济损失,研究了解ASPV的功能基因及治病机理,并诱导其表达,制备出高效的血清,将病害的损害度降到最低.[方法]用新疆库尔勒香梨携毒枝条的韧皮部提取苹果茎痘病毒RNA,根据已经公布ASPV(EU095327)核苷酸序列,设计合成1对CP基因的引物,通过RT-PCR扩增出CP基因,将其克隆至表达载体pET-3a中.[结果]经测序表明,目的基因CP已正确地整合至表达质粒中.[结论]重组质粒转化大肠杆菌BL21,在不同时间下诱导均获得了表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别.     

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273 bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432 bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化.结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率.     

Molecular,serological and biological characterization of a novel Apple stem pitting virus strain from a local pear variety grown in China

Apple stem pitting virus (ASPV) is an important causal agent of pear diseases. Nowadays, the infection status and molecular characteristics of the virus in old pear trees have never been investigated. In this study, we provide the first complete genome sequence of an ASPV isolate LYC from an over 300-year-old tree of a local Pyrus bretschneideri cultivar ‘Chili’ specifically grown at Laiyang area in China. ASPV-LYC possesses a chimeric genome consisting of 9 273 nucleotides excluding a poly(A) tail at its 3’ end and harboring a recombination region in its open reading frame (ORF1) with Aurora-1 and KL9 identified as the major and minor parents. Western blot analysis with antisera against recombinant coat proteins (CPs) of three ASPV isolates from pear indicates that ASPV-LYC is serologically related to these ASPV isolates, but with differential activities. Further biological tests on indicator plants of Pyronia veitchii show that ASPV-LYC can induce serious leaf and stem symptoms as other ASPV isolates. The results provide an important information for understanding molecular evolution of ASPV and suggest a need to prevent dissemination of the isolate among pear trees.     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

侵染中国甘蔗和玉米的SCMV CP基因序列多样性分析

【目的】揭示侵染中国甘蔗及玉米的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）的遗传多样性，为抗病品种培育及病害综合防治提供依据。【方法】以病株叶组织总RNA抽提物为模板，通过RT-PCR扩增及扩增产物直接测序获得了华南地区SCMV 26个甘蔗及玉米田间分离物的近全长CP基因序列，结合GenBank中已公布的部分相应序列，采用序列比对及分子系统进化树重建方法，对SCMV CP基因序列的变异性进行分析。【结果】中国SCMV可分为3个分子组群，各组群分别对应于各自来源的寄主，即杂种甘蔗(糖用甘蔗, Saccharum interspecific hybrids)、玉米(Zea mays)和高贵甘蔗（果用甘蔗,Saccharum officinarum）。CP基因核苷酸同一性，不同组群之间为78%～84%，同一组群内部各分离物之间大于91%。在分子系统进化树中，这3个分子组群各自聚集成簇，前两个组群分别隶属于Alegria等（2003）建立的甘蔗组（sugarcane group，SCE 组）和玉米组（maize group，MZ组），第3个组群为本研究首次发现，命名为高贵甘蔗组（noble sugarcane group，NSCE组）。侵染杂种甘蔗的SEC组不存在明显的地域分化，而侵染玉米和高贵甘蔗的MZ组和NSEC组则可对应地理来源分为若干亚组，前者可分为华东华中亚组、西北西南亚组及华南亚组，后者至少包括华南亚组和浙江亚组。在玉米、杂种甘蔗及高贵甘蔗混栽区，不同作物上的SCMV可以通过蚜虫传播而交叉侵染，但各组群间依寄主种类存在相对隔离现象。本研究还发现中国华南地区，SCMV可自然侵染甘蔗近缘属杂草河八王（Narenga sp.）和芒（Miscanthus sp.）。【结论】在中国，SCMV存在丰富的遗传多样性，其分化与寄主类型密切相关，可分为杂种甘蔗组、玉米组和高贵甘蔗组，其中玉米组和高贵甘蔗组又可根据地理来源分为若干亚组。在抗病品种的选育及病害综合防治中，必须充分考虑到病毒的这种分化现象。     

Genomic Analysis of the Natural Population of Wheat dwarf virus inWheat fromChina and Hungary

During the last decade, the leafhopper transmitted Wheat dwarf virus (WDV) has become a serious problem both in northwestern China and Hungary. In order to study the molecular diversity and population structure of WDV in these two countries, 39 Chinese isolates and 16 Hungarian isolates were collected from different regions of China and Hungary, and their genomes were sequenced. All isolates belonged to the wheat strain of WDV and showed limited genetic diversity. The highest and lowest nucleotide sequence identities among isolates from China and Hungary were 99.9 and 90%, respectively. In all isolates, the lowest nucleotide sequence identity was 89.5% between MO10-1 and KP10-5, which were collected from Martonvásár and Kompolt, Hungary. Phylogenetic analyses showed the genome sequences of 55 WDV isolates belong to two big clades, but no clear correlation to geographical location. Population difference analyses indicated that the Chinese and Hungarian WDV populations have no significant difference. The regions in WDV genome with relatively low nucleotide diversities represented protein coding regions suggested that these regions evolved under negative selection, and might be one of the causes restricting the number of genetic variants.     

柑橘衰退病毒柚类分离物CP基因的克隆及原核表达分析

以来自湖北省的HB柚柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)分离物(CTV-HB1)为材料,利用RT-PCR技术对其CP基因进行克隆,序列分析结果表明:CTV-HB1与典型茎陷点分离物SY568和NUagA的核苷酸和推定氨基酸的序列相似性均在97%以上,而与CTV速衰分离物T36和弱毒分离物T385和T30的核苷酸和氨基酸序列相似性较低,均在95%以下。将CP基因片段连接到表达载体,转化大肠杆菌后诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE和Westen-blot分析结果表明,经IPTG诱导后产生了预期大小的重组蛋白,该蛋白可与CTV-L5提纯病毒制备的多克隆抗体发生特异性免疫反应。     

Molecular diversity of barley yellow dwarf virus-PAV from China and the Czech Republic

Wheat yellow dwarf disease (BYD), caused by different species of barley/cereal yellow dwarf viruses (B/CYDVs), is one of the most serious cereal diseases in China and the Czech Republic. Because genetic diversity of the virus directly influences disease epidemiology, the molecular diversity and population structure of 24 Chinese isolates and 16 the Czech Republic isolates of BYDV-PAV from different regions in two countries were analyzed by sequencing their coat protein (CP) and readthrough protein (RTP) domain (RTD) genes and comparing the sequences with six CP and 16 RTP sequences of BYDV-PAV isolates from the NCBI database based on nucleotide identity position, phylogenetic analysis and nucleotide diversity. Nucleotide identities between the Chinese and the Czech Republic isolates for the CP were 76.6–99.4%, 73.9–89.1% for RTD (ORF5), respectively. The Chinese and the other country isolates showed 74.7–99.2% nucleotide identity for RTP (ORF3+ORF5). Phylogenetic analysis of CP sequences showed that 20 Chinese isolates clustered in the same clade, but the other four Chinese isolates clustered in another clade with the isolates from the Czech Republic and other counties. The population of BYDV-PAV in China had greater nucleotide variability and was more divergent than that in the Czech Republic. Geographical and ecological factors but not hosts might contribute to the population differences in the two countries.     

我国苹果病毒病的研究现状

我国从1978年开始对苹果病毒病进行系统研究,目前初步明确了我国苹果主产区主要病毒病的种类及特性,在病毒检测方面也取得了很大进展。介绍了我国苹果上主要病毒的特性,这些病毒包括苹果花叶病毒（ApMV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）、苹果绿皱果病毒（AgrCV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果茎沟病毒（ASGV）;阐述了这些苹果病毒病所采用的技术,包括指示植物、电子显微镜技术、血清学方法、分子生物学技术等。