猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达

根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后...     

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用

[目的]制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究.[方法]本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化.将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性.[结果]通过问接免疫荧光、Western-blot证明猪干扰素α和γ重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中均获得表达,表达产物主要分布在培养上清中.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到3.24×10<'7>U·mL<'-1>.在Marc-145细胞,昆虫细胞上清经2<'-11>稀释能够抑制100个TCID<,50>的PRRSV的致细胞病变作用.[结论]应用杆状病毒表达系统实现猪干扰素α和γ在昆虫细胞上分泌共表达,重组蛋白在细胞上对PRRSV具有抑制作用.     

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接新城疫病毒F蛋白基因和HN蛋白基因,并将构建好的融合基因克隆到载体pET28a,经测序后融合基因插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOX I和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白F-HN.重组质粒pPIC9K-F-HN经Sac Ⅰ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到转化...     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价

为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RTPCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,得到重组质粒pETVP7,酶切鉴定后,将pETVP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDSPAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。     

弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank中弓形虫表面抗原SAG3基因序列,以弓形虫总RNA反转录的cDNA为模板,扩增出SAG3去除信号肽基因并进行原核表达.将重组pET-28a(+ )-SAG3阳性表达质粒转入大肠杆菌BL(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.通过SDS- PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果表明:成功扩增了不合信号肽的SAG3基因,构建的原核表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,能够与鼠抗弓形虫阳性血清发生特异性反应,去信号肽的SAG蛋白具有反应原性.     

加强民营企业档案管理的意义

在建设具有中国特色的社会主义现代化强国的过程中，依据党和政府方针政策，民营企业作为公有制经济补充，起到了优化社会经济结构的作用，而民营企业档案管理，以往是个空白。为了适应社会主义现代化的建设，加强对民营企业的管理，是十分必要的，以求为政府部门如何加强管理服务，提供第一手资料，使其健康发展，政府监督更为有效。     

中国农村公共投资的准商业供给模式评价——以电力电话投资为例

利用来自全国6个省2 459个村的代表性的公共投资调查数据,对中国村级电力电话投资的准商业模式进行了评价研究。实证分析表明,作为利润最大化的单位,准商业企业对农村进行投资的策略,与政府实施农村公共投资(如道路等)的有所不同。如果没有政府管制,准商业化经营的电力电话公司在贫困的和地处山区的村庄的投资要少于在富裕的或平原地区的村庄。研究也发现,村庄拥有的关系网对村庄能获得的政府投资具有显著的正效应,但是对准商业模式供给的电力电话投资并不具有显著的效应。文章的结论主要是,在进行适当政府管制的前提下,准商业企业可以纠正自己的行为,从而在农村公共投资中采取更加减贫的策略。若此,准商业供给模式将可以在未来的中国农村公共投资中发挥更加重要的作用。     

小流域综合治理型农业生态旅游发展研究

目前,水土流失及环境污染越来越严重,小流域综合治理成为地方政府未来工作重点。中国流域资源丰富,可大力发展流域经济。同时,依托小流域综合治理,重点发展农业生态旅游。参照2002年农业部出台的中国十大农业生态模式,结合目前流域经济和农业经济发展现状,提出了基于小流域治理型的农业生态旅游发展模式。     

红壤小流域动态信息数据库的建立与管理优化——以浙江省金华市方下店小流域为例

通过对浙江省金华市方下店小流域ＡＰＴ４．０和ＧＩＳ动态信息数据库的建立、管理与优化，以及对这两种数据信息管理系统所绘制的平面二维图像和数据库结果的分析，直观地说明了小流域动态信息数据库在方下店小流域治理中所起的作用．另外，还探讨了数据库和高级语言程序结合的途径以及数据库技术在现阶段小流域治理和研究中所存在的问题     

调整农—企利益关系 完善农业产业化经营

通过合作获取潜在利益是农户和龙头企业进行联合开展农业产业化经营的动力所在。利益关系是农—企关系的核心,能否处理好双方利益关系是农业产业化经营能否健康发展的关键。从农—企联合的动因入手,从现实中龙头企业和农户之间利益冲突的现象和原因分析,提出调适农—企利益关系的必要性和可能的途径,并特别强调了政府作为公共产品提供者和社会利益调节者在其中的重要作用。     

一种新的结合SVM和FNN的多聚焦图像融合算法

产业融合共生是新时期红色旅游的必然选择，红色旅游企业共生系统可分为区域内共生子系统和区域外共生子系统，表现为核心共生、主要共生和跨界共生三种形态，核心共生形态是红色旅游企业共生区别其他企业共生的根本所在。红色旅游企业共生由合作和共识耦合而成，但核心共生形态的形成机理更多地表现为天然性，要求红色旅游企业主动寻求合作，争取与其他共生单元达成共识，促进红色旅游企业共生关系的良性发展。     

新时代下我国事业单位借鉴企业化绩效管理的若干探讨

在企业管理中,绩效管理始终受到极大的关注,是公司得以健康发展的有力保障。对于事业单位而言,虽业已引入绩效管理,其概念理论、建设工作、运用方式及达成目标均存在着一定程度的理解偏差或认知模糊,不利于新时代下事业单位的健康发展。文章通过界定事业单位的绩效管理概念,分析其自身特点,同时借鉴总结企业绩效管理的成功经验,对事业单位绩效管理的改进和完善提出一些思路和见解。     

我国转基因生物安全调查Ⅱ.转基因生物风险交流的途径与优先内容

为研究探讨建立适合我国国情的转基因生物风险交流机制与途径,本研究基于全国30个省（市、区）4 239多份问卷,对政府、企业、媒体、科学家和公众五类人群两两最佳交流途径进行了问卷调查分析。研究明确了不同类群之间的最佳交流途径,在此基础上初步确立了在我国开展转基因生物风险交流的可行模式、探讨了不同交流主体在转基因风险交流中的责任和义务。调查结果还表明,目前在我国开展转基因生物风险交流的媒体与手段首先应该是电视、网络和报纸/期刊。转基因生物风险交流侧重点应放在与公众身体健康确实密切相关的方面。     

市场提供农村公共产品对农户收入的影响分析

为探讨通过市场筹资渠道提供的公共产品对农户收入产生的影响及其影响机制,通过构建生产模型和消费模型,分别从农户收入和农户效用(公共产品消费)两方面揭示农村公共产品市场化供给对农户福利的影响机制,并采用陕西5个县20个村400户农户调研数据进行分析,发现市场提供的公共产品对农户收入有显著的正面效应。因此,建议中央政府在加大对农村的公共投资力度的同时,乡镇政府应创造市场筹资提供农村公共产品的更多渠道,实现农村公共产品供给的筹资多元化。     

日本大分县全球重要农业文化遗产保护与发展经验及其启示

笔者简述了中日申请全球重要农业文化遗产(GIAHS)基本情况,总结了日本大分国东半岛林—农—渔复合系统保护与发展GIAHS的良好经验,诸如政府宣传到位居民参与度高、合理确定政府和企业在保护中的角色定位、企业市场化运作程度高以及丰富体验活动传递重要理念等,在此基础上,从保护理念、管理机制、科学普及等方面对中国GIAHS 保护与发展提出了切实可行的建议,认为要注重GIAHS的动态性保护与适应性管理,要创新并探索建立政府与社会资本合作、互利共赢、良性互动、持续发展的运营模式,以及不断强化对内对外的宣传力度提高公众对GIAHS认知度与保护意愿。