鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

利用酿酒酵母表达抗菌肽Lvcrunstin-B

根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。     

利用酿酒酵母表达抗菌肽Lvcrunstin-B

根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。     

猪视黄醇结合蛋白在毕赤酵母中的表达及检测

采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。     

鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。     

水稻膨胀素基因OsEXP2在毕赤酵母中的表达

膨胀素是一类可以诱导失活细胞壁伸展的蛋白质,试验通过克隆水稻膨胀素(OsEXP2)基因并在巴斯德毕赤酵母中表达,以研究其对纤维素的作用。根据已知序列设计引物,经RT-PCR克隆OsEXP2基因,并插入毕赤酵母表达载体pGAPHα中,位于α-信号肽下游,得到重组质粒pGAPHα-OsEXP2。将其线性化后通过电转化,转化毕赤酵母菌株GS115,OsEXP2基因通过同源重组整合到毕赤酵母的基因组上,得到重组菌株GS115/pGAPHα-O-sEXP2。该菌株发酵液可使滤纸发生崩解现象,并使纤维素酶滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)提高了47.87%。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。