青年奶牛活体取卵技术的研究

本文利用B超活体取卵技术(ovumpickup,OPU)对青年荷斯坦奶牛活体取卵,探讨影响活体取卵的因素及对青年奶牛发情周期的影响。4头青年荷斯坦奶牛在连续观察两个发情周期后,进行连续的一周一次OPU操作,持续16周,然后观察OPU后的发情周期特征及卵巢状况。结果显示:在数量上,个体间穿刺卵泡的总数和回收卵母细胞的总数不完全一致,但卵泡直径的百分比构成个体之间无显著差异(P>0.05),回收率相似;在质量上,各级卵母细胞的构成在各个体间没有显著差异(P>0.05);OPU期间奶牛出现情期延长的趋势,且发情表现减弱,但停止OPU后发情基本正常。研究表明:利用活体取卵技术对青年荷斯坦奶牛进行每周一次的长期连续取卵,在一定的条件下,能够达到较为稳定的回收率和获得一定数量和质量的卵母细胞,但会导致奶牛发情周期的改变,而在停止OPU后能较快恢复。     

不同亚种牛卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析

在体细胞核移植(克隆)试验中,作为受体细胞的卵母细胞是制约克隆效率的重要因素之一.本文通过对鲁西黄牛和荷斯坦奶牛进行活体取卵(OPU)试验,并以两个不同亚种的卵母细胞分别作为受体细胞进行奶牛体细胞克隆和胚胎移植试验,经卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析,探讨以鲁西黄牛代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体的可行性.结果显示,夏季鲁西黄牛OPU的效果更好,用鲁西黄牛卵母细胞构建的重构胚的融合率显著高于荷斯坦奶牛;鲁西黄牛卵母细胞形成的克隆胚移植后,其妊娠率、产犊率和活产率与荷斯坦奶牛相当;采用不同亚种克隆胚和不同类型受体牛互相组合进行胚胎移植,结果表明亚种内移植组妊娠率明显高于亚种间移植组,而且亚种内移植组非妊娠牛的返情时间也明显推后.以上结果说明,鲁西黄牛可以代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体和胚胎移植受体牛;不同亚种受体牛与克隆胚的适当组合可以显著提高胚胎移植的效果.本研究为以后开展不同亚种间克隆提供了可行性参考.     

活体采卵技术在荷斯坦奶牛繁殖中的应用

[目的]为提高优质奶牛的繁殖力,保证低成本的情况下大量生产优质胚胎,对荷斯坦奶牛采用活体采卵的方式采集卵母细胞。[方法]将4头荷斯坦奶牛分为超排组和非超排组2组,超排组对试验牛注射FSH,非超排组对对照牛不采取任何处理。对荷斯坦奶牛进行活体采卵,并对卵母细胞数进行统计。[结果]共采集到12枚卵母细胞,经过受精培养后有8枚受精卵发育良好。[结论]采用优化的活体采卵程序并配合超排技术,能够更好地利用良种奶牛,以达到动物胚胎生产和辅助生殖的目的。     

奶牛活体采卵的影响因素分析

针对活体生物材料缺乏,活体采卵技术(Ovum pick-up)应运而生,因其具有系谱清楚适于科学研究而成为获取卵母细胞的主要途径之一。因此,研究活体采卵影响因素具有重要意义。就活体采卵在采卵间隔周期、超排处理、高产牛所处年龄段、患繁殖疾病与否及连续采卵进行试验,研究其采卵效率及对卵巢生理机能的影响。结果显示,①采卵间隔时间不同,以每周2次采卵所获卵母细胞数要多于每周1次的,差异不显著,但每周2次的优质卵母细胞率高于每周1次,且差异显著;②经超排处理后获卵母细胞数显著高于对照组,优质卵母细胞率有所提高,差异不显著;③青年牛和成年牛的平均获卵数和优质卵母细胞率差异均不显著;④健康牛平均获卵数显著高于患有繁殖疾病的牛只,优质卵母细胞率也显著高于患牛;⑤奶牛连续采卵和1次采卵的平均获卵率和优质卵母细胞率差异均不显著。综上,奶牛活体采卵受很多因素的影响,上述5方面的因素为主要影响因素。     

牛活体采卵及其在体外受精中的应用

利用超声波活体采卵技术(ovumpick-up,OPU)对奶牛的活体采卵技术进行了研究,探讨活体采卵频率以及用FSH处理后对卵母细胞回收的影响,并对比了活体采卵与屠宰场采卵体外受精后胚胎的发育。结果表明:每周采2次与每周采1次可获卵母细胞数差异显著;用FSH在采卵前3d处理不发情母牛和发情母牛,发现两组平均获卵数差异不显著,且回收率和优质卵母细胞率差异不显著;活体采卵和屠宰场采卵的优质卵母细胞数和囊胚率差异显著。     

体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。     

活体采卵时间间隔对牛克隆胚胎发育的影响

采用活体穿刺技术（ovum pick up,OPU）,分别间隔3／4（1周2次）、5、7、10、14d对同一批荷斯坦奶牛进行穿刺采卵,根据优势卵泡直径和所有卵丘细胞-卵母细胞复合体的状态确定采卵时卵泡所处的发育阶段,从而确定卵泡波的发育动态变化。并以间隔不同时间采卵获得的卵母细胞成熟后进行体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）制备克隆牛胚胎。重构胚体内培养7d后,通过比较克隆囊胚的发育率判定卵母细胞质量的差异,从而确定最佳的采卵时间间隔。结果显示：①穿刺采集所有直径超过3min的卵泡后,可起始1个新卵泡波,大约5d后从属卵泡开始进入凋亡阶段,7d后进入晚期凋亡阶段,第7～10d又起始1个新的卵泡波,第14d时第2个卵泡波中的从属卵泡起始凋亡。②间隔不同时间组克隆囊胚发育率存在差异,间隔3／4d（1周2次）为23．1％,间隔5d组为15．0％,间隔7d组为10．9％,间隔10d组为4．9％,间隔14d组为29．0％。结果显示：间隔不同的时间采卵,卵泡所处的发育状态存在差异。并对卵母细胞质量具有显著的影响。     

不同因素对南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响

探讨了卵母细胞的不同采集方法对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，抽吸法是合适的卵母细胞采集方法。同时还探讨了卵丘细胞层数和不同激素对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明激素对南阳牛卵母细胞的成熟率和卵裂率无显著影响；具有2～8层卵丘细胞的卵母细胞获得了较高的成熟率和卵裂率；具有8层以上卵丘细胞的卵母细胞的成熟率和卵裂率比较低；裸卵和半裸卵几乎不能够成熟和卵裂。     

活体采卵时间间隔对牛克隆胚胎发育的影响

采用活体穿刺技术（ovum pick up,OPU）,分别间隔3／4（1周2次）、5、7、10、14d对同一批荷斯坦奶牛进行穿刺采卵,根据优势卵泡直径和所有卵丘细胞-卵母细胞复合体的状态确定采卵时卵泡所处的发育阶段,从而确定卵泡波的发育动态变化。并以间隔不同时间采卵获得的卵母细胞成熟后进行体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）制备克隆牛胚胎。重构胚体内培养7d后,通过比较克隆囊胚的发育率判定卵母细胞质量的差异,从而确定最佳的采卵时间间隔。结果显示：①穿刺采集所有直径超过3min的卵泡后,可起始1个新卵泡波,大约5d后从属卵泡开始进入凋亡阶段,7d后进入晚期凋亡阶段,第7～10d又起始1个新的卵泡波,第14d时第2个卵泡波中的从属卵泡起始凋亡。②间隔不同时间组克隆囊胚发育率存在差异,间隔3／4d（1周2次）为23．1％,间隔5d组为15．0％,间隔7d组为10．9％,间隔10d组为4．9％,间隔14d组为29．0％。结果显示：间隔不同的时间采卵,卵泡所处的发育状态存在差异。并对卵母细胞质量具有显著的影响。     

不同因素对牛卵母细胞胞质内精子注射效果的影响

采用胞质内精子注射法（ICSI）构建牛显微受精胚胎,探讨卵母细胞成熟培养时间、精子状态及精子操作液中聚乙烯吡咯烷酮（PVP）浓度对牛卵母细胞胞质内显微受精（ICSI）卵体外发育的影响。结果显示：成熟培养20 h、24 h和28 h的卵母细胞用于ICSI时,ICSI卵的形态完整率分别为94.6%（175/185）、97.2%（173/178）和96.4%（189/196）（P〉0.05）;成熟培养24 h和28 h的卵母细胞,其ICSI卵的卵裂率（73.4%和70.9%）和囊胚发育率（31.8%和29.6%）显著高于成熟培养20 h的卵母细胞（61.1%和20.6%）（P〈0.05）。对成熟培养24 h的卵母细胞注射获能精子时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率（72.7%和31.4%）高于未获能精子组（69.4%和29.3%）和不运动精子组（71.5%和30.4%）,但无统计学差异（P〉0.05）。采用含5%,10%和15%PVP的精子操作液处理获能精子后对成熟培养24 h的卵母细胞进行ICSI操作,PVP浓度为5%和10%时,ICSI卵的卵裂率（73.2%和66.9%）和囊胚发育率（32.7%和29.7%）差异不显著（P〉0.05）,但二者均显著高于15%PVP浓度组的卵裂率和囊胚发育率（51.0%和16.3%）（P〈0.01）。结论认为,选用获能精子,并使用含5%PVP的精子操作液进行处理,对成熟培养24 h的牛卵母细胞进行ICSI操作,有利于ICSI卵的体外发育。     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

嘌呤核苷类核成熟抑制剂对延边奶山羊卵母细胞体外成熟的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟率及其后续发育能力。[方法]以延边奶山羊为试验对象,活体采卵所获得的卵母细胞为材料,利用核成熟抑制剂HX和IBMX分别进行体外成熟培养,研究嘌呤核苷类核成熟抑制剂对延边奶山羊卵母细胞体外成熟的影响。[结果]所有浓度HX和IBMX均可有效维持卵母细胞停留在GV期且呈剂量依赖性逐渐升高。最适宜延边奶山羊卵母细胞成熟的HX和IB-MX添加浓度分别为2和0.2 mmol/L。[结论]该研究可为延边奶山羊的转基因和体细胞克隆试验等提供稳定的成熟卵母细胞来源。     

p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系

【目的】 研究p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达特征及其与卵母细胞胞质氧化还原稳态的关系,为揭示p66Shc参与调控卵母细胞胞质氧化还原稳态分子机制提供理论依据。【方法】 试验所用卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes, COCs）来源于屠宰场的绵羊卵巢。分别收集成熟前优质和劣质、常规成熟24 h及成熟30 h老化的卵母细胞,采用实时荧光定量PCR对成熟前后不同质量绵羊卵母细胞中p66Shc mRNA的表达量进行分析,利用细胞免疫荧光结合MitoTracker Red探针对p66Shc蛋白和线粒体进行共定位,同时利用荧光探针DCFH-DA和卵母细胞自发荧光分别对成熟前后不同质量卵母细胞内ROS水平和氧化还原稳态进行检测。此外,采用外源H₂O₂诱导的氧化应激处理成熟前优质卵母细胞,并对p66Shc蛋白的表达及定位进行了检测分析。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA表达量分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。然而优质卵母细胞成熟前后p66Shc mRNA表达量没有显著差异（P>0.05）。共定位结果表明,p66蛋白主要分布在线粒体分布活跃的区域。细胞免疫荧光结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc蛋白表达量也分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态的失衡。此外,与未添加外源H₂O₂的对照组相比,外源H₂O₂处理成熟前优质卵母细胞诱导的氧化应激显著（P<0.05）上调p66Shc蛋白的表达并促使 p66Shc由胞质向细胞核定位。【结论】 p66Shc基因在劣质和老化的绵羊卵母细胞中呈现高水平的表达,H₂O₂诱导的氧化应激显著上调p66Shc蛋白的表达并影响其亚细胞定位。总之,绵羊卵母细胞中p66Shc表达上调影响了胞质的氧化还原稳态。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。