珠眉海棠水通道蛋白MzPIP1;1基因的克隆与表达分析

通过对珠眉海棠盐胁迫微列阵分析,从盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的水通道蛋白基因MzPIP1;1 cDNA序列全长1 135bp,开放阅读框共870bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是91和174bp。MzPIP1;1编码289个氨基酸,有6个跨膜结构和2个NPA(Asp-Pro-Ala)保守区。聚类分析表明:MzPIP1;1和其他4个物种PIP1类同源性在80%以上,属于质膜水通道蛋白PIP1类。拟南芥原生质体瞬时转化结果表明MzPIP1;1定位在质膜上。半定量RT-PCR表明MzPIP1;1基因受到盐和低温诱导。推断MzPIP1;1基因在盐胁迫下的表达调控与珠眉海棠耐盐能力密切相关。     

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

 【目的】从烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。     

陆地棉CC-NBS-LRR基因的克隆及特征分析

根据抗病基因核苷酸结合位点(Nuc leotide b ind ing site,NBS)设计简并性引物,从陆地棉cDNA中进行RT-PCR扩增。获得含NBS保守域的EST,进一步用RACE技术和TAIL PCR技术获得其中1个EST的全长基因序列,并获得GHNBS基因的5′调控序列。此基因被命名为GHNBS。该基因的编码区长2 583 bp,编码861个氨基酸,GHNBS编码的氨基酸序列与拟南芥R基因具有28%的同源性。GHNBS与拟南芥的其他几个NBS-LRR基因比较发现,它们在保守区外的相似性相当低。Southern杂交和网上数据库搜索分析都表明GHNBS是1个寡拷贝基因。通过半定量RT-PCR分析发现GHNBS在棉花的蕾、花瓣、韧皮部、根及叶中均有表达且在根、叶中表达量比其它部位强,在木质部基本不表达。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1的分离和特性分析

【目的】NPR1是调控植物抗病反应的一个关键基因。对中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1进行分离和特性分析。【方法】利用RT-PCR和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得TiNH1全长cDNA序列，利用Northern和Southern分别研究TiNH1表达特性及其在中间偃麦草基因组中存在形式。【结果】获得了该基因cDNA序列，命名为TiNH1。其编码蛋白TiNH1的氨基酸序列分别与水稻、烟草和拟南芥的NPR1同源性为80%、54%和46%。Northern杂交分析结果表明：TiNH1基因在正常情况下有微量表达，在小麦白粉病菌和纹枯病菌诱导下，该基因表达水平得到提高。Southern杂交分析结果表明；该基因以单拷贝形式存在于中间偃麦草基因组中。【结论】中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1编码由580个氨基酸组成的蛋白质TiNH，具有已知NPR1蛋白保守的结构域和功能氨基酸，可能参与寄主对小麦白粉病菌和纹枯病菌的防御反应。     

牡丹HSP70基因全长的克隆与序列分析

根据不同植物热激蛋白基因(HSP70)序列的保守区设计引物,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE),从牡丹叶片中获得了热激蛋白基因的全长cDNA,命名为PsHSP70,登录号为JN639533.该基因全长2 259 bp,开放阅读框长度为1 953 bp,编码含650个氨基酸的稳定蛋白,蛋白分子质量为71.25 ku...     

烟草谷氧还蛋白基因NbGRX1的克隆与表达特性分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(RACE),从烟草中克隆到1个谷氧还蛋白基因(Grx),命名为NbGRX1.该基因全长1 021 bp,编码298个氨基酸,具有典型的Grx基因结构域.Real-time RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,并且受低温、干旱和高盐诱导.     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.     

梨小食心虫普通气味结合蛋白2（GmolGOBP2）cDNA的克隆与原核表达

【目的】克隆梨小食心虫(Grapholita molesta)普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2)的全长cDNA序列并进行原核表达,为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆GmolGOBP2的全长cDNA序列,并使用原核表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用SDSPAGE和Western blot检测其表达情况。【结果】GmolGOBP2的cDNA全长序列为637bp(GenBank登录号:JN857940),开放性阅读框长度为483bp,编码161个氨基酸残基,成熟蛋白分子质量为15.98ku,等电点为4.85。GmolGOBP2预测蛋白的N末端具20个氨基酸残基组成的信号肽序列,并且氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸的典型气味结合蛋白家族标志。将GmolGOBP2编码序列重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,梨小食心虫普通气味结合蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出分子质量约为32ku的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子质量大小一致。【结论】克隆并原核表达了GmolGOBP2的cDNA序列,可用于研究该蛋白分子结构及其在化学感受系统中的功能。     

塔里木河叶尔羌高原鳅摄食和生长的研究

为了探讨叶尔羌高原鳅在高盐碱水域环境的摄食和生长,本研究通过鱼类生物学和渔业资源调查等研究方法,对2012-2013年在塔里木河干流阿拉尔段、阿拉尔周边排碱渠和台南河等3个不同水域的叶尔羌高原鳅样本237尾、水生生物和水质进行了测定和分析。结果显示:塔里木河叶尔羌高原鳅口裂较大,下口位,有高原鳅属鱼类类似的摄食器官和肠道,体肠比约为1,杂食性偏肉型;3个不同水域水质和水生生物差异较大,叶尔羌高原鳅适口饵料缺乏,摄食强度明显降低,抢食现象严重,残食现象明显,成活率差,生长性状不稳定。研究表明:塔里木河叶尔羌高原鳅应对不同水域,摄食形态未发生改变,但其食物组成有所变化,长期的适应中摄食行为可能会发生变化。     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代的适合度

【目的】抗除草剂转基因油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)的抗性基因一旦成功漂移到近缘杂草中,将会给农田杂草防除带来很大的困难。转基因油菜的近缘杂草野芥菜(wild B.juncea,AABB,2n=36)广泛分布于中国西部地区并沿长江流域扩散,因此有必要深入研究抗除草剂转基因油菜与野芥菜回交后代的适合度,为抗性基因是否能成功漂移到近缘杂草中提供试验依据。【方法】在田间以不同密度(低密度为15株/区,高密度为30株/区)单种和混种(野芥菜与回交后代以4﹕1、3﹕2、1﹕1比例混种)野芥菜及抗性回交3代子3代(抗草甘膦转基因油菜及抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代分别表示为BC_3mF_4R、BC3p F4R和BC_3mF_4L、BC_3pF_4L,m表示以野芥菜为母本的回交后代,p表示以野芥菜为父本的回交后代),测定抗性正反回交3代子3代的营养生长(株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量)和生殖生长(单株有效角果数、单株种子质量、角果长、每角果饱粒数)的适合度成分,并比较供试回交后代的总适合度与野芥菜的差异。【结果】在单种条件下,BC_3mF_4R和BC_3pF_4R的各适合度成分及总适合度均与野芥菜无显著差异;尽管在高密度下BC_3mF_4L和BC3p F4L的茎粗、地上部单株干生物量和单株有效角果数显著低于野芥菜,但BC_3mF_4L和BC_3pF_4L的总适合度仍与野芥菜无显著差异;因此,在单种条件下,抗草甘膦或抗草丁膦的回交3代子3代在低密度和高密度均具有与野芥菜相当的总适合度。当回交后代与野芥菜混种时,在低密度3种比例混种下,抗草甘膦和抗草丁膦的回交3代子3代的总适合度与野芥菜无显著差异;在高密度3种比例混种下,BC_3 F_4R与野芥菜的各适合度成分及总适合度无显著差异,但BC_3 F_4L的株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量、单株有效角果数、单株种子质量及总适合度均显著低于野芥菜。相关性分析结果表明,BC_3 F_4的各适合度成分仅与种植密度相关。【结论】抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子3代都具有在野外生存定植的可能性,且抗草甘膦的回交3代子3代比抗草丁膦的回交3代子3代的可能性更大。因此,在防范转基因油菜的基因逃逸时不仅要防范转基因油菜与近缘杂草的初始杂交,而且要防范杂交后代与近缘杂草的不断回交,以免产生适合度较高的回交后代。     

不同猎物饲喂对南方小花蝽捕食量和喜好性的影响

为探讨南方小花蝽对不同猎物的捕食喜好性,室内用西花蓟马、蚕豆蚜、二斑叶螨、混合饲料(同时饲喂3种猎物)分别饲喂南方小花蝽驯化两代,研究了4种饲喂处理的南方小花蝽初孵若虫、5龄若虫和雌成虫对西花蓟马、蚕豆蚜和二斑叶螨的捕食量和喜好性.结果显示不同猎物饲喂处理驯化的南方小花蝽1龄若虫对同一种猎物的捕食量和喜好性均不存在显著差异.南方小花蝽5龄若虫和雌成虫对某种猎物的捕食量因前期取食的猎物种类不同而有显著差异.南方小花蝽5龄若虫和雌成虫均表现出对西花蓟马2龄若虫的正喜好性.蚕豆蚜饲喂处理的5龄若虫和雌成虫对蚕豆蚜表现出正喜好性,除二斑叶螨饲喂处理外其余3种处理的南方小花蝽5龄若虫和雌成虫均表现出对二斑叶螨的负喜好性.以上结果表明4种饲喂驯化处理的南方小花蝽1龄若虫的喜好性不受前期取食猎物的影响,但5龄若虫和雌成虫对前期取食过的猎物的喜好性增强,存在一定的学习行为.     

朱砂叶螨TcGSTM7的体外表达及其功能

【目的】朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,长期化学防治导致其对多种药剂产生了抗性,因此明确该螨对化学药剂的解毒代谢机制对开展有效的抗性治理具有重要意义。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是节肢动物主要的解毒代谢酶之一,笔者前期研究中筛选出了朱砂叶螨体内高表达的一条GST基因TcGSTM7,该基因的表达在药剂处理下具有明显的可诱导性。因此,本研究以TcGSTM7为研究对象,进一步利用异源表达技术分析TcGSTM7重组蛋白和甲氰菊酯、丁氟螨酯的互作效应,以及利用RNAi沉默该基因的表达后,检测朱砂叶螨对这两种药剂的敏感性变化,为明确TcGSTM7在药剂代谢中的功能打下基础。【方法】利用NCBI数据库对TcGSTM7编码蛋白的序列特征进行注释,并在SWISS MODEL构建的蛋白三维结构中对相关结构域、结合位点以及活性中心等进行展示。利用异源表达系统在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达TcGSTM7重组蛋白,对重组蛋白进行分离纯化后使用特异性底物检测其GST催化活性,并通过检测杀螨剂对该蛋白活性的抑制效果分析其与甲氰菊酯和丁氟螨酯的互作效应。在此基础上,为明确TcGSTM7基因表达水平对朱砂叶螨药剂敏感性的影响,参照该基因的序列设计并合成特异dsRNA,利用叶碟饲喂法将其导入朱砂叶螨体内,经qPCR检测TcGSTM7表达水平显著下调后,进行生物测定分析基因沉默后朱砂叶螨对不同剂量甲氰菊酯和丁氟螨酯药剂敏感性的变化。【结果】TcGSTM7的氨基酸序列分析结果表明,其N端具有一个Mu家族GST特有的"thioredoxin-like"结构域,以及一个GSH的结合位点(G-site),在C端则具有催化底物结合域(H-site)。该蛋白具有9个α螺旋和4个β折叠结构,呈经典的"βαβαββα"排列方式。在三维结构预测的基础上,通过原核表达技术获得了TcGSTM7重组蛋白,该重组蛋白分子量为26 kD,与预测结果一致,并且具有GST蛋白的催化活性。TcGSTM7重组蛋白酶活性为673.26nmol·min-1·mg~(-1),其动力学常数Km为0.71 mmol·L~(-1),Vmax为109.54 nmol·min-1·mg~(-1)。药剂抑制试验结果表明甲氰菊酯和丁氟螨酯均可抑制TcGSTM7重组蛋白的酶活性,IC_(50)分别为0.038和0.2 mmol·L~(-1)。进一步利用叶碟饲喂法让朱砂叶螨取食dsRNA,对TcGSTM7的表达进行了干扰,qPCR检测表明取食48 h后,dsRNA对TcGSTM7的干扰效率达到52.88%。药剂敏感性测定结果显示,沉默TcGSTM7的表达后,朱砂叶螨对LC_(30)和LC_(50)的甲氰菊酯敏感性分别上升了9.0%和12.3%,对LC_(30)和LC_(50)的丁氟螨酯敏感性分别上升了12.9%和11.0%,且均达到显著水平(P0.05)。【结论】TcGSTM7的表达可以影响朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性,且其重组蛋白和这两种药剂存在互作效应,表明TcGSTM7可能在朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的代谢过程中具有重要作用。     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

小麦中镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染现状与防控研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,又称呕吐毒素,是由小麦赤霉病菌禾谷镰刀菌复合群（Fusarium graminearum species complex）产生的单端孢霉烯族毒素,毒素在小麦籽粒中累积。作为B型单端孢霉烯族毒素,DON可以引起呕吐、拒食、腹泻、出血甚至死亡, 对猪的危害尤其严重。近年来,小麦赤霉病在世界各地高频率流行,尤其在中国长江中下游小麦生产区以及黄淮部分小麦产区、美国中西部小麦主产区,导致小麦中DON毒素严重超标,并引发了严重的食品安全问题。本文对国内外小麦中DON毒素的污染现状、产毒镰刀菌种类及其化学型的分布及其趋势、毒素产生的调控机制以及小麦中DON毒素的防控途径进行了论述,希望有助于镰刀菌毒素污染小麦质量安全的风险评估、监管以及科学处置。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。