布鲁氏菌病病原快速检测方法的建立

根据编码牛种布鲁氏菌外膜蛋白（OMP-2）基因的核苷酸序列设计1对PCR引物,并对PCR扩增条件进行优化,建立了快速检测布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,该引物对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出193bp目的基因片段,但不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠结肠炎耶氏菌（0：9型）的目的基因片段;敏感性检测显示,乳样的检测灵敏度达50cfu／mL、纯化的布鲁氏菌DNA检测灵敏度达1．5pg,可重复性和稳定性十分理想。可见,该布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,能为快速诊断布鲁氏菌病提供技术支撑。     

布鲁氏菌病病原快速诊断方法建立及应用

研究目的:建立检测布鲁氏菌病病原巢式PCR快速诊断方法,并采用该方法进行样品检测.方法:对布鲁氏菌omp22基因设计巢式PCR引物,以布鲁氏菌基因组为模板,来检测布鲁氏菌病病原.对金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、棒状杆菌、绿脓杆菌、李氏杆菌等常见菌群及羊基因组进行阴性对照检测,并用本方法进行血样的检测,采用RBPT检测对应的血清样本.结果及结论:结果表明对动物的常见发病菌检测为阴性,所建立布鲁氏菌病病原PCR快速诊断方法有很好的特异性和敏感性,应用本方法对378份血样进行PCR检测,较之对应血清的RBPT检测结果,具有灵敏、特异、准确的特点,有较好的实用价值.     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。     

致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测.     

奶牛GPR109A基因SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础。【方法】根据Gen Bank中奶牛GPR109A基因和β-actin基因(内参基因)的m RNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验。【结果】GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2=0.9997),扩增效率分别为101.0%和100.0%。特异性试验结果显示,GPR109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7%。【结论】基于GPR109A基因建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析。     

基于HSP60基因哈氏弧菌PCR检测方法的建立

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法.结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA.表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断.     

布鲁菌PCR检测方法的建立及其应用

本文根据已发表布鲁菌BCSP31基因序列,设计1对引物,以布鲁菌19号苗基因组DNA作为模板,建立诊断牛布鲁菌病的PCR方法,并对方法的特异性、敏感性及适用性进行验证.结果显示,PCR能扩增布鲁菌BCSP31基因特定序列.该方法对布鲁菌的最小检出量为9pg,对葡萄球菌26001株、大肠杆菌O78等7种参照菌株的核酸扩增结果均为阴性.建立的PCR方法具有快速简便、特异性强、敏感性高等特点.     

猪繁殖障碍疫病的三重PCR法鉴别诊断

为建立一种简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）3种病原的多重PCR方法，针对PRRSVN基因、PPVVP2基因及PRVgp50基因分别合成了1对特异性引物，通过PCR均扩增出分子长377bp、445bp和217bp的DNA条带，与预期扩增片段相符。以3对引物同时对PRRSV、PPV和PRV疫苗株进行多重PCR扩增及反应条件的优化，同时扩增出3条特异性条带。利用所建立的多重PCR方法，对贵州省11个养猪场的40份疑似病料进行检测，结果显示，PRRSV、PPV和PRV的阳性检出率分别为62．5％、17．5％和0％。     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

连续多重PCR牛胚胎性别鉴定

本实验以BOV97M序列和牛的1．715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增，其中前者为雄性特异扩增，后者为雌雄共同扩增，以进行牛的性别鉴定。PCR扩增共进行43个循环，其中前11个循环为雄性特异扩增，在随后的33个循环中，再加入内标引物，即进行多重PCR扩增，其灵敏度可达到10pg级(约3个细胞)。     

荧光定量PCR技术研究进展及其应用

荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,更以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为分子生物学研究的重要工具,并用于生物特异核苷酸的检测.主要概述了荧光染料法、TaqMan探针法、分子信标法、Lux Primer 4种荧光定量技术的原理、特点以及荧光定量PCR技术在各方面的应用.     

牛促卵泡激素基因克隆筛选和序列分析

从牛垂体中分离出总mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,经T4DNA聚合酶切成平末端后与Sma I酶切的pUC19连接,转化JM83,构建了脑垂体mRNA的cDNA文库.用标记的牛促卵泡激素基因的寡核苷酸片段进行杂交,从文库中筛选到几个阳性克隆,其中一个含有全长的牛促卵泡激素基因编码序列.利用PCR扩增技术从cDNA中扩增出了387bp的牛促卵泡激素基因,序列分析表明,10号克隆中的牛促卵泡激素基因含有起始密码ATG及终止密码TAA,所编码的氨基酸序列与天然牛促卵泡激寡素的氨基酸序列相同.     

PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

用聚合酶链式反应穴PCR雪技术检测饲料中沙门氏菌,对已知被沙门氏菌污染的动物饲料的培养物均能检出阳性,说明PCR方法对检测饲料中沙门氏菌具有特异性高,且灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测饲料中沙门氏菌的需要。     

转基因食品PCR定性检测的研究进展

以靶序列的选择、DNA提取和产物的检测为主线,概括了PCR(PolymeraseChainReaction,PCR)在定性检测基因修饰有机体(Geneticallymodifiedorganisms,GMOs)中的应用,指出了存在的问题以及未来的发展方向。     

柿树带化和刺槐丛枝的PCR检测

根据植物菌原体１６ＳｒＲＮＡ基因序列,合成一对寡核苷酸引物,用ＳＤＳ ＣＴＡＢ改进法直接提取田间发病的柿树带化病、刺槐丛枝病树和健康树皮层的ＤＮＡ,用ＰＣＲ方法成功地从病树ＤＮＡ模板中扩增出约１．１７ｋｂ的特异产物,经酶切进一步证实为植物菌原体１６ＳｒＤＮＡ．此项研究表明用特异合成的引物Ｆ１６／Ｒ１６,经ＰＣＲ扩增可以快速灵敏地检测植物菌原体．     

益生地衣芽孢杆菌天门冬氨酸激酶Ⅱ基因的PCR扩增及序列分析

通过聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增得到了益生地衣芽孢杆菌Ｈ８８ － ３ 株天门冬氨酸激酶（Ａｓｐａｒ ｔｏｋｉｎａｓｅ,ＡＫ） Ⅱ基因,并用ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ ３７７ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ 进行序列测定,所得核苷酸序列及推导的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌ＶＢ２１７ 株进行了比较,结果它们的同源性非常高。     

聚合酶链反应法进行Puumala病毒RNA扩增的研究

应用ＰＣＲ技术进行Ｐｕｕｍａｌａ病毒核酸片段的特异性扩增．将为进一步研究Ｐｕｕｍａｌａ病毒和相关病毒．以及检测此类病毒感染提供更加特异、敏感、快速的方法。依据已知的Ｐｕｕｍａｌａ病毒核酸序列，从Ｍ节段选出５对寡核苷酸作为ＰＣＲ反应中的引物，以Ｐｕｕｍａｌａ病毒ＲＮＡ作为模板。做ＰＣＲ。ＰＣＲ产物分别经凝胶电泳和核酸杂交的方法进行测定，结果表明。目的核酸片段得到了很好的扩增。     

桑树随机扩增DNA多态性研究

改进桑叶ＤＮＡ分离方法后得到了纯度较高、分子量约２３ｋｂ的ＤＮＡ，用２４个随机引物进行ＰＣＲ扩增后，供试１２个桑品种显示出较丰富的ＤＮＡ随机扩增多态性。