利用PCR技术体外扩增牛Y染色体特异DNA序列的研究

本实验建立了用ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列的方法。根据牛的ＳＲＹ序列设计一对引物，两条引物均为２３ｂｐ，对公牛１９４ｂｐ序列进行体外扩增。从屠宰的公、母牛肝和血液中提取ＤＮＡ，用作ＰＣＲ模板，ＰＣＲ仪内进行扩增。结果表明公牛个体样品显示清晰可见的特异ＤＮＡ扩增带，而母牛个体样品无扩增片段出现，与预期的结果完全符合。     

人结核病病原菌型的PCR指印分析

以结核分枝杆菌特异插入序列ＩＳ６１１０两端序列为模板,设计一对外向ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增,从而建立一种结核分枝杆菌的快速分子生物学分型技术,该试验的基础是利用ＩＳ６１１０在结核分枝杆菌染色体ＤＮＡ中反复重复且ＩＳ６１１０序列之间相距较近,经ＰＣＲ扩增呈现多条带型构成ＤＮＡ指印。采用ＰＣＲ指印技术,对人结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌进行分型,５７份痰标本呈现７种ＰＣＲ指印。该ＰＣＲ分型技术对结核     

烟草黑胫病菌分子检测

随着聚合酶链式反应 (ＰＣＲ)技术的发展 ,用特异引物进行真菌种间核糖体ＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增以达到鉴定生物种的目的已成为一种简便、快捷的技术和方法。本试验根据从ＧｅｎｅＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅ获得的疫霉属真菌 (Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｐｐ .)ｒＤＮＡＩＴＳ区段序列 ,合成了 1对 1 7ｂｐ特异寡聚核苷酸引物进行了不同病原菌、病组织及土壤中寄生疫霉菌 (Ｐａｒａｓｉｔｉｃａｖａｒ.ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ)的特异扩增试验 ,提供并完善了一套快速检测该菌的技术和方法。1　材料与方法1 1　供试菌株　烟草疫霉菌菌株 ,交…     

鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

利用PCR检测柑桔黄龙病病原研究

对引起柑桔黄龙病的类菌原体的ＰＣＲ检测方法进行了研究。结果表明，利用ＰＣＲ方法不但能对ＢＬＯ，ＤＮＡ进行离体扩增，而且对各种不同来源的感病植物样品也能很好地进行检测。本首次报道了从未显症的植物上用ＰＣＲ方法检测到了ＢＬＯ，枝接试验证实了该方法的可靠性。     

甘蔗宿根矮化病菌 ＰＣＲ检测体系的优化与应用

为建立能快速灵敏检测甘蔗宿根矮化病 （ｒａｔｏｏｎｓｔｕｎｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ,ＲＳＤ）的 ＰＣＲ检测方法。本文通过改进模板 ＤＮＡ的制备方法,在 ＰＣＲ基本程序的基础上,以甘蔗宿根矮化病菌 （Ｌｅｉｆｓｏｎｉａｘｙｌｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉ,Ｌｘｘ）１６Ｓ-２３ＳｒＤＮＡ基因间隔区特异性引物,调整 ＰＣＲ扩增反应体系各组分的浓度、反应的退火温度、循环参数等主要因子,优化 ＰＣＲ反应体系。此检测体系能从感染 ＲＳＤ的样品中扩增出大小为４３８ｂｐ的特异性片段,而阴性对照和未感染样品则未扩增出任何片断;未优化仅从稀释３０倍的蔗汁总 ＤＮＡ中扩增出 ＲＳＤ的特异性片段,优化后可以从稀释３０００倍的蔗汁总 ＤＮＡ中扩增出 ＲＳＤ的特异性片段。对３１份田间采集样品检测,未优化的阳性检出率为 ３２.２６％;优化后阳性检出率 ７４.１９％,与 Ｉ-ＥＬＩＳＡ检测结果一致。应用此检测方法可稳定、快速地检测出蔗株是否感染 ＲＳＤ,且检测效率高,适合于田间大批量样品快速检测。     

利用PCR检测柑桔黄龙病病原研究(英文)

对引起柑桔黄龙病的类菌原体（ＢＬＯ）的ＰＣＲ检测方法进行了研究．结果表明,利用ＰＣＲ方法不但能对ＢＬＯ、ＤＮＡ进行离体扩增,而且对各种不同来源的感病植物样品也能很好地进行检测．本文首次报道了从未显症的植物上用ＰＣＲ方法检测到了ＢＬＯ,技接试验证实了该方法的可靠性．正是由于本方法可在病原侵染早期进行检测这一优点,从而可控制带病苗木的扩散．该技术也可被用于无毒苗木的筛选,从而控制病害发生．该技术对ＢＬＯ引起的黄龙病的检测不但简单、有效而且实用     

用RAPD技术对4种螺原体菌DNA多态性的初步研究

用随机扩增的多态性ＤＮＡ技术对螺原体３个血清组中的４个菌株进行ＤＮＡ多态性研究。ＰＣＲ扩增引物选自Ｏｐｅｒｏｎ随机引物试剂盒中Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、组的１２０个引物。４个菌株为２３－６，ＣＲ－１和ＣＨ－９１－１，ＣＣＨ。     

猪ESR基因一个外显子DNA片段的分子克隆

参考人、鸡,鼠的ＥＳＲ基因序列,设计一对引物,采用ＰＣＲ技术扩增出猪的ＥＳＲ基因一段ＤＮＡ片段,将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体中,重组质粒经ＰＣＲ鉴定和酶切分析确定克隆成功,经测序结果分析确定该片段为猪ＥＳＲ基因与其他动物第４号外显子相对应的一段ＤＮＡ片段,大小为３３２ｂｐ。     

用PCR-差别筛选法分离和克隆水稻抗瘟性相关基因(英文)

以水稻抗瘟性近等基因系Ｈ７Ｒ和Ｈ７Ｓ为材料,采用ＰＣＲ－差别筛选（ＰＣＲｂａｓｅｄｄｉｆｅｒ－ｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）的方法分离和克隆水稻受稻瘟病菌诱导的抗性相关基因．第一轮筛选获得４２个差异表达的ｃＤＮＡ克隆,经ＰＣＲ扩增,转膜,反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交后,得到１２个阳性ｃＤＮＡ克隆．本文对ＰＣＲ－差别筛选的优缺点以及进一步的鉴定工作亦作了讨论．     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法

 【目的】建立直接从多种线虫混合样品以及香蕉和红掌根组织中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。【方法】使用Primer Premier 5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计1对特异性引物,运用PCR技术对目的线虫DNA进行特异性检测。【结果】通过对17种24个种群线虫的检测表明,所设计的引物只能从香蕉穿孔线虫种群中特异扩增出rDNA-ITS片段,产物大小为518 bp。利用该特异引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系,可以直接从香蕉穿孔线虫与短体线虫、螺旋线虫、肾状线虫、根结线虫、茎线虫、矮化线虫、纽带线虫、丝尾垫刃线虫、滑刃线虫和小杆线虫混合样品中特异扩增出目的线虫的rDNA-ITS片段,并可以分别从混合有不少于3条香蕉穿孔线虫的2 cm香蕉或红掌根组织（约0.1 g）中特异检测出目的线虫的DNA片段。【结论】本研究设计的特异性引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系可直接从多种线虫混合的样品以及香蕉和红掌根组织中快速检测鉴定出香蕉穿孔线虫。     

苹果黑星病菌的早期分子检测

苹果黑星病(Venturia inaequalis)是中国苹果产区的重要病害之一,为了建立该病原菌的早期快速检测技术,筛选出了对苹果黑星病菌具有特异性的PCR引物.利用这对引物能从苹果黑星病菌基因组DNA中扩增出一条分子量为190 bp的特异性条带,准确地把苹果斑点落叶病、苹果褐斑病和苹果白粉病等常发性苹果叶斑病害区分开.采用改进的CTAB法,快速提取发病叶片组织的DNA,并结合PCR检测技术,可从苹果黑星病显症叶片以及未显症而处于潜育期的叶片组织中特异性地检测到苹果黑星病菌.结果表明,建立的苹果黑星病菌分子检测方法,可用于该病害的早期快速分子诊断.     

Detection and Identification of Phytoplasmas from the Apple Proliferation Group on Fruit Crops

Phytoplasmas from the apple proliferation (AP) group collected and isolated from the territory of the Russian Federation and some European countries have been studied, including their detection and identification. Analysis of 67 samples of fruit crops by nested PCR using universal primers for 16–23S ribosomal RNA regions has shown the presence of the AP group phytoplasmas in some samples. Candidatus Phytoplasma mali, a causal agent of the apple proliferation disease, has been revealed in samples from Spain; Ca. Phytoplasma pyri (pear decline disease) was found in samples from Italy, Spain, and the Republic of Dagestan; and Ca. Phytoplasma prunorum (European stone fruit yellows disease) was found in samples from the Czech Republic. Data on the DNA sequencing of the identified pathogens have been deposited into the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).     

植原体病害研究进展

植原体原称类菌原体,是一类重要的植物病原物,主要靠韧皮部取食的刺吸式昆虫介体传播。本文从4个方面综述了植原体的研究概况:(1)植原体的分类,包括了传统分类和16SrRNA分类系统;(2)植原体的分子检测方法,包括血清学法、核酸杂交法、PCR法和LAMP检测方法;(3)植原体的传播,包括媒介昆虫类群如叶蝉、蜡蝉和木虱及其传播过程;(4)植原体的综合治理,包括加强检疫、治理寄主植物和治理介体昆虫。此外,还对植原体的今后研究进行展望。     

羊流产衣原体的PCR检测方法研究

根据羊流产衣原体16SrRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼衣原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的卵黄囊膜均未扩增出相应的片段。敏感性试验表明,该体系可检测到2pg的衣原体DNA。     

苦瓜抗白粉病SRAP标记筛选的PCR体系优化与验证

【目的】优化苦瓜抗白粉病SRAP标记的PCR体系,为获得苦瓜抗白粉病的SRAP分子标记、加快苦瓜抗白粉病新品种的选育提供参考。【方法】采用正交设计L16（45）,在已有SRAP-PCR扩增程序基础上,以苦瓜抗、感白粉病的父母本及其杂交后代基因组DNA为模板,用4对SRAP引物对模板DNA、dNTPs、Mg2＋、引物、TaqDNA聚合酶等5个因素浓度进行优化组合和验证。【结果】提取的苦瓜基因组DNA纯度较好,无蛋白质、RNA等物质污染,其纯度和完整性较好。利用引物对ME9-EM11进行PCR扩增,16个不同因素组合处理在苦瓜父本MC18和母本MC1-2的基因组DNA间的扩增结果有明显差异,其中以处理3的SRAP-PCR体系（20.0μL：DNA5.0ng/μL、dNTP0.05mmol/L、Mg2＋2.5mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶0.088U/μL）获得较清晰、较多的扩增条带。用4对引物对验证优化的SRAP-PCR体系,其重复性好,不同苦瓜材料间无明显的多态性。【结论】优化的SRAP-PCR体系适用于苦瓜抗白粉病SRAP分子标记的筛选。     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

苦瓜抗白粉病SRAP标记筛选的PCR体系优化与验证

【目的】优化苦瓜抗白粉病SRAP标记的PCR体系,为获得苦瓜抗白粉病的SRAP分子标记、加快苦瓜抗白粉病新品种的选育提供参考。【方法】采用正交设计L16（45）,在已有SRAP-PCR扩增程序基础上,以苦瓜抗、感白粉病的父母本及其杂交后代基因组DNA为模板,用4对SRAP引物对模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶等5个因素浓度进行优化组合和验证。【结果】提取的苦瓜基因组DNA纯度较好,无蛋白质、RNA等物质污染,其纯度和完整性较好。利用引物对ME9- EM11进行PCR扩增,16个不同因素组合处理在苦瓜父本MC18和母本MC1-2的基因组DNA间的扩增结果有明显差异,其中以处理3的SRAP-PCR体系（20.0 μL：DNA 5.0 ng/μL、dNTP 0.05 mmol/L、Mg2+ 2.5 mmol/L、引物0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.088 U/μL）获得较清晰、较多的扩增条带。用4对引物对验证优化的SRAP-PCR体系,其重复性好,不同苦瓜材料间无明显的多态性。【结论】优化的SRAP-PCR体系适用于苦瓜抗白粉病SRAP分子标记的筛选。     

检测疫苗中猪肺炎支原体污染的PCR-斑点杂交法和套式PCR法比较研究

为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究.结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应.对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%.以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中具有推广应用价值.