玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术

【目的】 玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫,可侵染多种禾本科作物的根部,玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系,以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫,为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】 从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫;选取13条含有10个碱基的随机引物,采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析,筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段,并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物;采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】 通过RAPD比对分析,发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段;将该片段回收测序,根据片段序列信息,利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1;特异性检测结果表明,HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段,其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带;以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时,特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段,而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段;该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的;对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试,表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力,检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】 本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术,可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测,对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力,检测引物特异性强,检测方法便捷稳定,灵敏度高。     

基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫快速分子检测技术

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA（RAPD）和特征序列扩增区域（SCAR）标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。     

旱稻孢囊线虫的快速分子检测

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。     

菊花滑刃线虫快速分子检测

根据菊花滑刃线虫(Aphelenchoides ritzemabosi)和相近滑刃线虫种群的rDNA-ITS序列,设计出菊花滑刃线虫特异性引物,利用PCR技术对菊花滑刃线虫包含部分5.8 S基因和部分rDNA-ITS2核苷酸序列进行扩增,获得208 bp的特异性片段.实现了单条活的或FG(4 %的甲醛)固定的菊花滑刃线虫的快速检测.     

基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L^-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。     

植物罹病组织中象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法

【目的】建立一种基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术,从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）的快速检测方法,为象耳豆根结线虫的监测和防治提供技术支持。【方法】根据象耳豆根结线虫与其它根结线虫ITS序列差异设计LAMP特异性引物,通过对LAMP反应条件中的Mg2+、dNTPs、甜菜碱和反应时间进行优化,同时对检测体系的特异性和灵敏度进行验证,建立一种从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法。【结果】象耳豆根结线虫LAMP检测体系优化结果表明在Mg2+的浓度为5.0 mmol•L-1、dNTPs的浓度为2.4 mmol•L-1、不添加甜菜碱、反应时间为45 min的条件下,扩增效率最优。本研究建立的LAMP检测方法能够从11个植物线虫种群中特异检测出象耳豆根结线虫,检测灵敏度为1/200000头线虫DNA,比普通PCR灵敏100倍,能够直接从植物根结中检测出象耳豆根结线虫,准确度为100%。【结论】本研究以rDNA-ITS序列为靶基因建立象耳豆根结线虫LAMP快速分子检测方法,具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征,能够从罹病植物组织中快速准确地检测出象耳豆根结线虫,具有极高的实践应用价值。     

1种苎麻根腐病线虫的鉴定

【目的】对分离的一种苎麻根腐病线虫进行形态和分子生物学鉴定,为病原线虫分子生物学检测技术的研发及苎麻根腐病的防治奠定基础。【方法】从感染苎麻根腐病植株根中分离出一种植物病原线虫,利用显微技术观察线虫的形态特征,对其进行初步鉴定;之后采用分子生物学技术,提取单条线虫的DNA,利用通用保守性引物扩增了线虫核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,并用软件DNAstar和DNAMAN进行序列分析,对该植物病原线虫进行进一步鉴定。【结果】根据形态特征,将获得的苎麻根腐病线虫初步鉴定为咖啡短体线虫。序列分析结果表明,该线虫rDNA-ITS序列与咖啡短体线虫湖北种群、越南种群、台湾种群、日本种群及尼日利亚种群的同源性依次为99.8%,99.0%,98.0%,97.8%和94.6%。该线虫rDNA-ITS序列在GenBank注册号为HQ403649。【结论】形态及分子生物学鉴定结果表明,分离的苎麻根腐病线虫为咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)。     

1种苎麻根腐病线虫的鉴定

【目的】对分离的一种苎麻根腐病线虫进行形态和分子生物学鉴定,为病原线虫分子生物学检测技术的研发及苎麻根腐病的防治奠定基础。【方法】 从感染苎麻根腐病植株根中分离出一种植物病原线虫,利用显微技术观察线虫的形态特征,对其进行初步鉴定;之后采用分子生物学技术,提取单条线虫的DNA,利用通用保守性引物扩增了线虫核糖体DNA内部转录间隔区（rDNA-ITS）序列,并用软件DNAstar和DNAMAN进行序列分析,对该植物病原线虫进行进一步鉴定。【结果】 根据形态特征,将获得的苎麻根腐病线虫初步鉴定为咖啡短体线虫。序列分析结果表明,该线虫rDNA-ITS序列与咖啡短体线虫湖北种群、越南种群、台湾种群、日本种群及尼日利亚种群的同源性依次为99.8%,99.0%,98.0%,97.8% 和94.6%。该线虫rDNA-ITS序列在GenBank注册号为HQ403649。【结论】 形态及分子生物学鉴定结果表明,分离的苎麻根腐病线虫为咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)。     

香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生性和致病性

 【目的】利用从进口观赏植物上截获,并培养保存在胡萝卜愈伤组织上的香蕉穿孔线虫10个种群,研究香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生和致病性。【方法】采用温室盆栽接种方法,进行寄生和致病性测定。【结果】香蕉穿孔线虫在烟草和芒果根际的繁殖率Rf＞1,接种香蕉穿孔线虫的烟草和芒果植株生长缓慢、矮小,根系衰弱、变色腐烂,有明显受害症状。【结论】烟草和芒果是香蕉穿孔线虫新的适合寄主植物,香蕉穿孔线虫对这2种植物具有明显的致病性,不同种群的致病力有差异。     

我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定

【目的】短体线虫(Pratylenchus spp.)是植物根系内迁移性寄生线虫,可引起许多作物的根腐线虫病,给世界农业生产造成了极大的危害。为明确我国黄淮麦区与禾谷孢囊线虫复合侵染小麦的短体线虫种类,本研究对采自黄淮4省麦区的10个短体线虫样品进行种类的分子鉴定,分析种群系统进化关系及种内遗传变异,以期为我国小麦根部线虫病害的综合防治提供指导。【方法】对采自江苏、安徽、河南和山东4省小麦孢囊线虫发病田中的10个小麦短体线虫样品进行线虫分离,从各样品中随机挑取5条短体线虫,分别提取单条线虫DNA,扩增r DNA 18S片段并进行测序比对,选取序列有代表性的2个DNA样本进一步扩增其r DNA 28S D2-D3区以及mt DNA-COI基因片段,经序列比对分析后,利用MEGA4.0软件采用邻接法分别构建基于r DNA 18S、28S D2-D3和mt DNA-COI序列的系统进化树,通过聚类关系及相似度分析确定线虫种类,同时利用种特异性引物进行验证。【结果】扩增挑取的50条短体线虫的r DNA 18S区片段,测序得到片段长度在857—935 bp,BLAST比对分析揭示部分样品可能为短体线虫的混合种群;进一步测定的20个代表性DNA样本的r DNA 28S D2-D3区和mt DNA-COI基因的片段长度分别在771—784 bp和415—417 bp;系统进化树以及相似度分析揭示我国黄淮流域4省麦区10个短体线虫样品中有咖啡短体线虫(P.coffeae)、落选短体线虫(P.neglectus)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri),其中,江苏沛县样品JS2和山东潍坊样品SD1是落选短体线虫单一侵染样品,河南永城样品HN2和安徽淮北样品AH3是咖啡短体线虫单一侵染样品,安徽萧县样品AH2、AH5和淮北样品AH4以及河南永城样品HN1和HN3均为落选短体线虫和咖啡短体线虫的混合侵染样品,江苏徐州样品JS1是落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫的混合侵染样品。用SCAR特异性引物扩增20个短体线虫单条DNA样本,结果显示,用落选短体线虫特异性引物PNEG-F1/D3B5能够从JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10个样本中扩增出140 bp的单一条带,用咖啡短体线虫引物PC1/PC2能够从AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9个样本中扩增出630 bp的单一条带,用斯克里布纳短体线虫引物Ps F7/Ps R7从JS1-1中扩增出130bp的单一条带,种类鉴定结果与上述序列分析结果相一致。【结论】我国黄淮流域4省小麦孢囊线虫发病田中的短体线虫种类有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫,其中落选短体线虫是优势种,证实了短体线虫不同种群复合侵染小麦的现象较为普遍。基于mt DNA-COI基因构建的系统进化树可以有效区分短体线虫的近缘种,相比r DNA 18S和28S基因更适于作为短体线虫种类鉴定的分子靶标。     

Parasitism and pathogenicity of Radopholus similis to Ipomoea aquatica,Basella rubra and Cucurbita moschata and genetic diversity of different populations

Ten populations of Radopholus similis from different ornamental hosts were tested for their parasitism and pathogenicity to water spinach(Ipomoea aquatic), malabar spinach(Basella rubra), and squash(Cucurbita moschata) in pots. The results showed all three plants were new hosts of R. similis. Growth parameters of plants inoculated with nematodes were significantly lower than those of healthy control plants. All R. similis populations were pathogenic to the three plants, but pathogenicity differed among populations from different hosts. The same R. similis populations also showed different pathogenic effects in the three different plants. Rad N5 population from Anthurium andraeanum had the highest pathogenicity to the three studied plants. Rad N1 from A. andraeanum had the lowest pathogenicity to squash and Rad N7 from Chrysalidocarpus lutesens had the lowest pathogenicity to water spinach and malabar spinach. R. similis is usually associated with root tissues, but here we report that it could be found to move and feed in the stem bases of all three studied plants. Sequence and phylogenetic analyses of DNA markers of the 18 S r RNA, 28 S r RNA, ITS r RNA, and mitochondrial DNA gene sequences of ten R. similis populations revealed significant genetic diversity. Rad N5 and Rad N6 populations from anthurium showed a close genetic relationship and could be distinguished from other populations by PCR-RFLP. At the same time, Rad N5 and Rad N6 populations were the most pathogenic to three studied plants. These results confirm the e xistence of large biological variability and molecular diversity among R. similis populations from the same or different hosts, and these characteristics are related to pathogenic variability.     

基于rDNA-ITS的中国外来香蕉穿孔线虫种群的系统发育分析

为揭示传入中国的香蕉穿孔线虫群体间的遗传差异,分析其亲缘和进化关系,明确中国香蕉穿孔线虫的来源和传入途径,分别扩增了多雌繁殖群体和相应种群的单雌繁殖群体后代rDNA-ITS,对扩增产物进行测序,通过序列比对分析其遗传变异,并构建系统发育树研究其亲缘和进化关系。结果表明:供试香蕉穿孔线虫20个种群的rDNA-ITS序列大小为705~713bp,序列同源性比较高,相似性在95%以上,序列变异率为0~7.5%;各群体ITS1和ITS2序列大小分别为273~276bp和151~152bp,各种群间的序列相似性分别达到98.58%和98.35%以上;单雌繁殖群体与相应的多雌繁殖群体的序列相似性非常高,有8个种群的2个繁殖群体序列相似性达到100%,其他种群的2个繁殖群体序列相似性达97%以上;基于ITS序列构建穿孔属线虫的系统发育树说明,所有香蕉穿孔线虫聚在一个大枝,分成4小分枝,其中寄主为红掌的RsW种群单独聚为一枝,遗传距离较远,寄主为绿宝石的RsH遗传距离相对其他种群也较远,寄主分别为天鹅绒竹芋和孔雀竹芋的RsP和RsS种群的遗传距离则相对较近,这说明传入中国的香蕉穿孔线虫种群可能直接来源是欧洲的竹芋科和天南星科观赏植物,而前者的最初来源可能是苏丹的香蕉,后者的最初地理来源较复杂。     

葡萄金黄化植原体16SrDNA检测与RFLP分析

[目的]对多种植原体16SrDNA基因序列进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析比较,以期区分葡萄金黄化植原体不同亚种,从而为葡萄金黄化植原体的鉴定提供新依据.[方法]用植原体通用引物R16mF2/R16mR1扩增7种不同植原体16SrDNA基因序列,得到约1.5 kb的DNA片段,将此片段克隆到PGM-T载体,并通过酶切鉴定,对重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性分析,利用限制性内切酶XmnⅠ、XspⅠ、TaqⅠ和Rsa Ⅰ对目的片段进行酶切电泳分析.[结果]所扩增2个不同亚种的葡萄金黄化植原体D型和C型序列同源性最高,达99.72;,但利用限制性内切酶可以将上述2个亚种从植原体榆树黄化组中区分.[结论]利用限制性内切酶分析通用引物R16mF2/R16mR1所扩增的基因片段,可以将葡萄金黄化植原体区分.     

红掌毁灭炭疽菌的分子检测

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486 bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的菌株时没有相应的特异性条带.该...     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除快速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.