冷冻保护剂和平衡方法对鸡胚原始生殖细胞冷冻保存效果的影响

采用Ficoll密度梯度离心，提取第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs)，应用不同的冷冻保护剂和平衡方法进行冷冻保存。PGCs解冻后用DMEM培养液进行体外培养，并采用苔盼蓝染色法鉴定复苏后PGCs的存活情况。结果表明：①从第19期或第28期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护剂下，平衡方法对PGCs的存活率有显著或极显著影响，平衡方法1的冷冻保护效果优于平衡方法2。②采用相同的平衡方法，冷冻保护剂C的冻存效果与其他保护剂之间存在显著或极显著差异，冷冻保护剂E和F对PGCs的冻存效果次之，冷冻保护剂A、B和D对PGCs的冻存效果最差。复苏后PGCs进行体外培养．其存活时间与分离后PGCs直接培养相比未出现显著缩短现象。     

鸡原生殖细胞(PGCs)的提纯及其超低温保存

利用密度梯度离心从孵化51～56h的鸡胚血液中提纯PGCs,通过形态鉴别和过碘酸－希夫试剂染色方法判定提纯的PGCs的纯度在80％左右。将提取到的PGCs放入到含有10％二甲基亚砜的TCM－199中,在液氮中进行保存。将超低温冷冻保存了1个月、6个月和12个月的PGCs（各3管）分别复苏后,用台盼蓝染色,通过红细胞计数板计数鉴定冷冻保存了不同时间的PGCs的平均存活率分别为91．7％、92．6％和91．9％。结果表明所采用的冷冻保存的方法是可行的。所采用的超低温冷冻保存方法简单易行,为今后以PGCs为目的细胞进行超低温冷冻,而后制作种系嵌合体进行保种的研究提供有利的实践基础。     

鹅原始生殖细胞体外分离与冷冻保存方法的比较研究

为了建立针对鹅原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的分离纯化与冷冻保存方法,对血液Ficoll密度梯度离心法、血液ACK裂解法、生殖腺胰酶-EDTA消化法与生殖腺消化结合体外短时间培养法4种PGCs分离方法以及STEM-CELLBANKER、CELLBANKER 2与10%DMSO加90%血清等3种冻存液进行了比较研究。通过形态学观察、糖原染色与PGCs特异免疫荧光染色鉴定PGCs,同时利用台盼蓝染色检测PGCs活力等方法对其分离和保存效果进行评价。结果表明,从鹅胚血液与生殖腺中均已经成功分离到鹅PGCs;生殖腺消化结合体外短期培养法与传统的血液分离法相比,获得的鹅PGCs数量、纯度与活力最高,每枚胚胎获得的鹅PGCs数量达到115个、细胞纯度达80.8%、细胞活率达88.3%;而商业化的干细胞冷冻保护液STEM-CELLBANKER同一般的体细胞冻存液相比更适合鹅PGCs的冷冻保存,冷冻解冻后的细胞存活率达90%左右。试验可以得出结论:生殖腺消化结合体外短期培养法成功分离到数量与纯度都可观的鹅PGCs,STEM-CELLBANKER冻存液能够用于鹅PGCs的长期冷冻保存。     

人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的比较

【目的】比较人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的复苏率,建立高效的冷冻保存方法。【方法】利用慢速冷冻、开放式和密闭式玻璃化冷冻3种方法保存人胚胎干细胞克隆,比较这3种方法的复苏效率,并通过免疫组化染色检测复苏后细胞的OCT-4表达。【结果】开放式快速冷冻方法的克隆复苏率为(97.5±5.0)%,密闭式快速冷冻方法的克隆复苏率为(96.7±5.8)%,均极显著高于慢速冻存方法(25.7±4.1)%。解冻后的胚胎干细胞克隆仍然保持胚胎干细胞的特性。【结论】开放式和密闭式玻璃化冻存方法能够高效保存人胚胎干细胞。     

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

小鼠-猪种间核移植胚胎玻璃化冷冻保存

以小鼠卵丘细胞为供核细胞,猪体外成熟去核卵母细胞为受体,构建小鼠-猪种间体细胞核移植(iSCNT)胚胎,并以猪体细胞核移植(pSCNT)胚胎为对照,采用开放式拉长细管(OPS)法对所获iSCNT胚胎进行冷冻保存,研究不同冷冻保护液(ES、EFS和EDFS)及胚胎不同发育阶段(2-、4-、8-细胞)对冷冻效果的影响。结果显示:小鼠-猪iSCNT胚胎卵裂率与猪pSCNT胚胎相比无显著差异(P>0.05),但其8-细胞发育率则明显较低(28.1%对56.8%,P<0.05)。采用ES液作为冷冻保护液,iSCNT胚胎冻后存活率与EDFS组相似,但显著高于EFS组(28.6%和22.7%对9.5%,P<0.05);与其他发育阶段相比,2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎可获得最高的冻后存活率;小鼠-猪iSCNT各期胚胎的冻后存活率均低于pSCNT组,但无统计学差异(P>0.05)。结果表明,以ES液为冷冻保护液,选择2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎进行OPS法冷冻保存,可获得相对较高的冻后存活率,但iSCNT胚胎的冻后存活率和体外发育能力均较pSCNT胚胎低。     

不同方法对STO细胞冻存效果的影响

[目的]建立一种更优化的STO细胞冷冻保存方法.[方法]STO细胞传至第3代后,调节其浓度至2.09×105个/mL,开展冷冻保存试验.Ⅰ组将STO细胞置于4℃下平衡,1 h后转入-20℃下,12 h后将其转至液氮中保存;Ⅱ组将STO细胞装入已注入250 mL 95％乙醇的降温器后,立即转至-70℃下,12 h后再将其转至液氮中保存;Ⅲ组将STO细胞悬液于液氮面上方10 cm处平衡20 min,然后将其缓缓转至液氮中.同时,设Ⅳ组为对照组,即STO细胞不进行冷冻处理.在液氮中保存30 d后进行解冻,以STO细胞的回收率、存活率和生长情况为研究指标,通过MTT法进行STO细胞冻存效果评价.[结果]经冷冻处理后,3种方法STO细胞解冻后回收率和存活率均存在显著差异(P<0.05).Ⅱ组细胞解冻后细胞回收率低于Ⅰ组、高于Ⅲ组,但细胞存活率最高(84.91％).与Ⅰ组和Ⅲ组相比,Ⅱ组STO细胞冻存方法不仅能保证冷冻效果,而且可以回收更多的细胞.Ⅱ组STO细胞复苏后生长相对缓慢,但STO细胞经培养后可恢复至冷冻前的生长状态.Ⅰ组和Ⅱ组复苏后STO细胞的增殖速度较快,且增殖率基本相同,而Ⅲ组细胞的增殖速度较慢.[结论]Ⅱ组STO细胞于-70℃冰箱中平衡过夜,再转移至液氮中超低温冷冻是较为理想的保存方法.     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

[目的]了解玻璃化冷冻一解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础.[方法]利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1～2d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响.[结果]与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低(P＜0.01).水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5 μmol/L离子霉素激活5 min联合2mmol/L 6-DMAP培养2h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6％、45.1％、33.7％和14.8％.[结论]水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活.     

麦穗鱼囊胚细胞的分离与冷冻保存

为了探讨麦穗鱼囊胚细胞的分离方法及其较佳的冷冻保存条件,采用胰蛋白酶酶解法和低温冷冻保存技术对麦穗鱼囊胚细胞的分离和保存进行研究。结果显示,20℃微流水条件下,受精后120 min左右麦穗鱼胚胎发育达到囊胚期;25℃条件下,0.25%胰蛋白酶作用12~18 min,麦穗鱼囊胚细胞即可脱去胚胎膜,且所获的囊胚细胞存活率可达90%以上;10%DMSO+DMEM作为冷冻储存保护液,储存于-80℃超低温冰箱中8 d,囊胚细胞存活率保持在50%以上;储存于-196℃,8 d后囊胚细胞存活力可达70%以上,储存128 d后,细胞存活率仍可保持60%以上。表明25℃、0.25%胰蛋白酶作用是较好的麦穗鱼囊胚细胞卵膜去膜条件,10%DMSO+DMEM保护液、细管和液氮(-196℃)保存囊胚细胞128 d可保持其有60%以上的存活率。     

绵羊体外受精囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以常规的慢速冷冻法为对照,研究了玻璃化冷冻法保存绵羊体外受精囊胚的效果.对于绵羊体外受精囊胚,两种冷冻方法间的囊胚存活率没有明显差异,但玻璃化冷冻组的囊胚孵化率显著高于慢速冷冻法组(分别为76.8%和41.0%,P＜0.05).将冷冻解冻后的绵羊囊胚移植后,玻璃化冷冻组的怀孕率和产羔率明显高于慢速冷冻法的.同时比较了绵羊体外受精囊胚细胞取样后,经不同时间培养后的玻璃化冷冻保存效果.囊胚取样后培养2 h或5 h,胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率显著高于对照组(分别为75.0%、50.0%,78.8%、69.7%和41.2%、26.5%,P＜0.05).培养10h后,胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率有所降低.结果表明,应用玻璃化冷冻法可以较好的冷冻保存绵羊体外受精囊胚及切割取样后的囊胚,绵羊体外受精囊胚切割取样后,经过2～5h时的恢复培养可以提高其抗冻能力.     

绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。     

氨苄西林的体外抗菌后效应及抗菌后亚抑菌浓度效应研究

采用菌落计数法测定了氨苄西林对4株细菌的体外抗菌后效应(PAE),以及对2株细菌的体外抗菌后亚抑菌浓度效应(PASME)。结果显示,氨苄西林在0.5,1,2,4×MIC浓度时,对金黄色葡萄球菌C26112的PAE值分别为1.14±3.05,1.62±2.11,1.87±1.70和2.45±1.31h,对金黄色葡萄球菌临床分离株的PAE值分别为1.05±1.84,1.38±1.25,1.56±1.35和2.29±2.04h;对大肠杆菌ATCC25922和临床分离株的PAE很小甚至没有;在1/8,1/4,1/2×MIC时对金黄色葡萄球菌C26112及临床分离株的PASME值分别为3.61±1.38,4.75±2.18,6.8±1.51h和3.01±2.5,4.2±1.21,5.9±1.23h;氨苄西林对金黄色葡萄球菌的PAE(0.5～4×MIC)及PASME(1/8～1/2MIC)与浓度在一定范围内呈剂量依赖性,并且在亚抑菌浓度下也具有PAE,当药物浓度达4×MIC时,PAE明显延长(P<0.05),且所测得的PASME较PAE长。所有结果提示:在临床设计给药方案时,对金黄色葡萄球菌敏感株引起的临床感染,除了考虑药代动力学和MIC指标外,还应考虑PAE和PASME因素,可适当延长给药间隔时间;而对PAE无意义的大肠杆菌敏感株引起的临床感染,宜持续给药或缩短给药间隔,也可达到较好的治疗效果。     

奶牛趾间皮肤外植体模型的构建及效果评价

为建立一种可用于奶牛蹄部感染性疾病研究的皮肤外植体模型，本研究利用气液交界面皮肤组织培养模式离体培养健康奶牛后蹄趾间皮肤，分别于培养0、12、24、36、48和72 h收集皮肤组织并采用HE染色法、原位末端标记(TUNEL)法及免疫组织化学方法对外植体的病理组织变化、组织细胞凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3表达进行检测。结果表明：1)与0 h对照组模型相比，培养12、24和36 h的皮肤组织表皮结构完整，真皮层发生不同程度变性；36 h皮肤组织上皮细胞出现变性迹象；48 h皮肤组织上皮细胞发生不同程度变性、坏死，并伴有核固缩；72 h皮肤组织表皮脱落、缺失，皮肤附属器官发生不同程度坏死，无法保持正常的组织结构和功能。2)皮肤外植体细胞发生不同程度凋亡，Caspase-3蛋白呈阳性表达，且表皮中凋亡细胞数量及Caspase-3蛋白阳性表达情况高于真皮。与对照组相比，24 h皮肤外植体细胞凋亡情况出现显著差异(P<0.05),36 h皮肤外植体Caspase-3蛋白阳性率出现显著差异(P<0.05)。本研究构建了一种稳定的奶牛趾间皮肤外植体模型，离体培养24 h仍保持正常的...     

Cell Ultrastructure of Kiwifruit （Actinidia chinensis） Shoot Tips During Cryopreservation

The changes in the cell ultrastructure of in vitro cultured shoot tips from dwarf genotype of kiwifruit （Actinidia chinensis Ganmi 5） during cryopreservation were investigated. Shoot tips were preserved in liquid nitrogen using vitrification, and the cell ultrastructure was examined using transmission electron microscopy （TEM）. The regular ultrastructure of the cell wall, cell membrane and nucleus of shoot tips could be damaged during the freezing and thawing associated with preservation using liquid nitrogen. The cell plasmolysis was increased and freezing tolerance was improved after precultufing and dehydrating in a preservation and vitrification solution （PVS2） （30% glycerol （Gly）＋ 15% ethylene glycol （EG）＋ 15% dimethylsulfoxide （DMSO） ＋ 0.4 mol L^-1 sucrose）. The structure of some cells with low degree of injury and reversible damage was similar to that of the control and they could undergo normal cell division and differentiation. Besides, they could recover automatically and regenerate after their reculture.     

西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生长特性、耐药性分析

为确定引起西藏牦牛常发多发肺炎的细菌病原体，采集145份西藏牦牛鼻腔粘液，通过病原分离培养、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等方法进行细菌检测；通过OD₆₃₀和pH变化对分离株进行生长曲线测定；采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。结果显示:从145份牦牛鼻腔粘液中分离得到10株牛支原体；分离株菌落形态和生化试验结果均符合牛支原体的生物学特性；通过PCR分别扩增得到238 bp的uvrC特异性基因与1 500 bp 16S rRNA基因。10株分离株间的uvrC特异性基因和16S rRNA基因序列同源性较高，均与国际标准株PG45有高度同源性，uvrC特异性基因序列和16S rRNA基因序列与国际标准株PG45的同源性分别为98.4%~100%和99.1%~99.9%。生长曲线测定表明，分离株在PPLO培养基中培养24 h内为迟缓期，培养42 h后开始进入稳定期，78 h后开始进入衰亡期；3个分离株培养物的平均pH随着培养时间延长不断降低，其中24~42 h期间pH下降最快，随后下降速度减慢，至78 h后几乎不再变化。药物敏感性试验表明，分离株对大环内酯类、氨基糖苷类和林可胺类等药物均存在不同程度的耐药，但对强力霉素和卡那霉素敏感或中度敏感。     

Controlled Freezing and Open-Pulled Straw (OPS) Vitrification of In vitro Produced Bovine Blastocysts Following Analysis of ATP Content and Reactive Oxygen Species (ROS) Level

To our knowledge, no single study has systemically compared cryopreservation efficiencies of bovine blastocysts derived from in vitro fertilization (IVF), intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) by controlled freezing and vitrification. This experiment, therefore, was designed to compare the cryopreservation of these blastocysts with controlled freezing and OPS vitrification. Adenosine-5′-triphosphate (ATP) content and reactive oxygen species (ROS) level in blastocysts were also analyzed. Firstly, for each type of blastocyst (IVF, ICSI or SCNT), significant differences were observed between the survival rates of the controlled freezing ((81.56±2.33), (68.18±4.72) or (47.89±5.83)%) and OPS vitrification groups ((92.24±4.54), (82.40±3.76) or (78.71±5.91)%; P<0.05). Secondly, for each type of blastocyst (IVF, ICSI or SCNT), ATP content was significantly decreased after controlled freezing or vitrification, and the ATP content in the controlled freezing group (0.43±0.06), (0.35±0.05) or (0.21±0.02) pmol) was significantly lower than that found in the OPS vitrification group (0.62±0.04), (0.46±0.03) or (0.30±0.01) pmol; P<0.05). Thirdly, ROS level in fresh IVF ((47.33±3.56) c.p.s (counted photons per second), ICSI ((36.51±2.58) c.p.s) or SCNT blastocysts ((26.44±1.49) c.p.s) was significantly lower than that found in the OPS vitrification group ((72.14±4.31), (58.89±3.89) or (40.11±5.73) c.p.s; P<0.05), but higher than that of the controlled freezing group (34.41±3.32), (23.13±1.26) or (15.46±2.45) c.p.s; P<0.05). The present study indicated that vitrification is more efficient in the cryopreservation of bovine blastocysts derived from IVF, ICSI or SCNT than controlled freezing. Furthermore, both vitrification and controlled freezing significantly altered the ATP content and ROS level in those blastocysts.     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

不同饲养层对兔原始生殖细胞传代培养的影响

为了探讨不同饲养层细胞对兔原始生殖细胞体外培养与传代的影响,从14~18 d的兔胎儿生殖嵴中分离得到原始生殖细胞(PGCs),分别培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、兔胎儿成纤维细胞(REF)饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)、兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。观察兔类EG集落的生长状态,并检测其碱性磷酸酶活性。结果表明:4种方法均能分离克隆出兔类EG集落,碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法传代培养兔PGCs。     

饥饿程度对大鼠学习记忆能力影响的实验研究

目的 探究不同的饥饿程度对大鼠的空间学习记忆能力的影响。方法 将84只成年健康雄性SD大鼠随机分为8组,A-G组分别饥饿处理6、18、24、30、36、42 h,H组饱食处理作为对照组,应用Morris水迷宫对SD雄性大鼠进行行为训练,评价其对大鼠空间学习记忆能力的影响。结果 （1）A-G组不同饥饿处理的各组大鼠定位航行实验潜伏期呈现先减小后增大的趋势,饥饿24 h组VS对照组（22.58±4.44）s VS（29.23±6.81）s,P<0.01;饥饿36 h组VS对照组（35.58±4.89）s VS（29.23±6.81）s,P<0.05。空间探索实验穿越原平台次数,饥饿24 h组VS对照组：（3.18±0.72）次VS（2.33±0.67）次,P<0.05;饥饿42 h组VS对照组：（1.64±0.64）次VS（2.33±0.67）次,P<0.05,呈现先增大后减小的趋势;同样,目标象限滞留时间百分比也是呈现先增大后减小的趋势,饥饿24 h组VS对照组（40.06±3.65）% VS（33.64±4.55）%,P<0.05;饥饿42 h组VS对照组（26.70±4.50）% VS（33.64±4.55）%,P<0.05。（2）上述实验结束后的G组连续饥饿处理42 h定位航行实验的潜伏期呈现减小后缓慢增加的趋势,连续饥饿处理时间6 h VS连续饥饿处理时间24 h（28.74±5.24）s VS（20.88±4.3）s,P<0.01;连续饥饿处理时间6 h VS连续饥饿处理时间30 h（28.74±5.24）s VS（19.97±6.14）s,P<0.01。结论 短期的饥饿（18 h和24 h）有助于大鼠空间学习记忆能力的提高,长期的饥饿（36 h和42 h）处理使大鼠的学习记忆能力下降。     

Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat

A total of 219 embryonic-germ-cell-like （EG-like） clumps were derived from 15 selected goat fetuses. Isolation of primordial germ cells （PGCs） based on co-culture with primary goat embryonic fibroblast showed no difference from traditional feeder layer-based culture method used in mouse and human. The putative primary EG colonies were multilayer clumps of compact cells with unclear cell-cell boundaries. Three subculture methods of goat EG-like colony, traditional enzymatic digestion, mechanical cutting and combination of the both, were compared in this study. As a result, EG-like colonies traditionally disassociated with collagenase 1V could be subcultured for up to 4 passages. And the mechanically disaggregated EG-like colonies were successfully maintained 9-12 passages with or without enzymatic treatment. The pluripotency of the EG-like colonies was identified by their specific marker staining, spontaneous differentiation and embryoid bodies （EBs） formation in vitro. Most goat EG-like colonies （〉 80%） were AKP positive and immunocytochemically characterized with positive SSEA-1, Oct-4 and c-kit staining but SSEA-4. Under the condition of delaying passage, goat EG-like cells could differentiate into fibroblast-like, epithelium-like, and neuron-like cells. In addition, EBs could be obtained successfully in routine hanging drop culture. The serum free culture system （feeder layer-based） used in this study was suitable for keeping PGCs and EG-like cells in their undifferentiated condition, but failed to converse them to immortal cells. These results indicated that mechanical cutting is an effective method for passaging goat EG cell colonies. However, the microenvironment of conversing EG cells to immortal cells is still unclear.