藏羊源屎肠球菌的分离、鉴定及体外益生特性

为了获得藏羊源益生菌，利用形态学、生化试验和分子生物学方法对屎肠球菌进行分离与鉴定，通过抑菌试验、耐受性试验、生长曲线与产酸能力试验以及药敏试验对屎肠球菌分离菌株的体外益生特性进行评价。结果显示，藏羊源屎肠球菌分离菌株EF1-mh在Pfizer肠球菌选择性琼脂上呈棕黑色菌落，胆汁七叶苷培养呈黑色等生理生化结果符合肠球菌特征，分离株16S rDNA序列分别与参考屎肠球菌序列相似性均达99%以上，PCR成功扩增出种特异性基因ddl和adk基因，明确分离菌株EF1-mh是屎肠球菌。分离株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌分离株的抑菌圈直径均在8.64 mm以上；分离菌株具有一定耐受性，于60 ~ 80 ℃水浴30 min培养16 h后，活菌浓度基本恢复。 在pH 2.0培养16 h活菌浓度为3.4×10² CFU·mL^-1；在pH 3.0培养4 h，活菌浓度为9.5×10⁶ CFU·mL^-1；在0.3%胆盐的 MRS 培养液中培养8 h活菌浓度为1.37×10³ CFU·mL^-1，在1%和2%胆盐的培养液中培养16 h仍有存活；生长速度快，4 h后进入了对数期，且培养10 h后菌液pH在4.3左右，产酸能力强，对氨苄西林、克林霉素等抗生素表现敏感，对多粘菌素B、头孢氨苄等抗生素表现为耐药。研究表明藏羊源屎肠球菌分离菌株EF1-mh具有较好的体外益生特性，这将有利于为藏羊源屎肠球菌的研究。     

马腺疫链球菌新疆株2种新SeM基因型的鉴定及其遗传变异分析

为了解马腺疫链球菌新疆流行株的基因型、菌株的遗传多样性和系统发育特征,采集新疆地区某马场患病马匹下颌组织病样,分离马腺疫链球菌（Z422、JMC111）,并对分离菌株进行生化特性和耐药特性检测,然后进行16S rRNA基因序列比较和SeM基因分子分型。结果显示,2株分离菌均为马链球菌马亚种,对头孢噻呋、头孢西丁、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺异恶唑敏感,对青霉素、头孢呋辛、氨苄西林、克拉霉素耐药。基于16S rRNA基因序列的分析显示2株菌均归属于 Ⅰ 群,基因分型鉴定为新的SeM基因型：seM 208和seM 209。     

草鱼源致病性维氏气单胞菌的鉴定及其黏附特性分析

采用表型鉴定与细菌16S rRNA基因序列分析对从患病草鱼体内分离的病原菌株16-1进行分类鉴定,综合该菌株的表型特征与16S rRNA基因序列,确定其为维氏气单胞菌。随后,对该菌株的细胞黏附特性及其携带的黏附素基因进行检测与分析。结果显示,分离菌株能以聚集性方式黏附于鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）周围,平均黏附菌数随共孵育时间延长而增加,90 min达到峰值,说明该分离株具有良好的细胞黏附性。黏附因子检测表明,该菌株同时携带ompAI、ompAII和ahl13种黏附素基因,这些黏附素基因在分离菌株与不同来源参考株之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别介于95.8%～99.5%和95.0%～100%（ompAI）,96.3%～99.1%和97.9%～100.0%（ompAII）,78.6%～99.6%和75.5%～99.4% （aha1）,说明所携带的ompAI和ompAII黏附素基因在不同来源的维氏气单胞菌之间具有较高的保守性。     

多杀性巴氏杆菌分离鉴定及序列分析

旨在了解新疆地区多杀性巴氏杆菌主要流行株的特性。通过病原的分离纯化、PCR扩增及测序,分析8株多杀性巴氏杆菌的血清型,16S rDNA基因、ompH基因和ompA基因的差异。结果表明,3株羊源、2株牛源和1株禽源分离株为荚膜A型,1株牦牛源分离株为荚膜B型,1株标准株为荚膜E型,均具有很强的致病性。分离株与GenBank公布的代表株的16S rDNA基因、ompH及ompA基因同源性分别为93%~100%、93%~100%、98%~100%。ompH基因的ORF氨基酸C端最后10个氨基酸变化较大,分离到5株ompA基因的ORF氨基酸序列N端多出6个氨基酸（M-K-R-I-I-Q）替代原先的起始位置。可见：新疆主要流行株为强致病性的荚膜A型,且有出现变异趋势。     

绵羊肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

为研究绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）侵害山羊的组织嗜性、筛选其最佳培养基及建立快速检测方法,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,以Mo Y98株16S rRNA基因重组质粒pMD19 MoFQ为模板,通过优化反应体系构建标准曲线,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因的FQ PCR方法,并对所建方法进行重复性、特异性、敏感性及应用性检测。结果表明,所建Mo 16S rRNA基因检测FQ PCR方法具有较好的重复性、特异性、临床应用性,Mo核酸拷贝最低检出量可至10 μL^-1。该方法不仅可作为Mo临床检测方法,且为后续Mo研究工作提供技术支持。     

猪源嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定与生物学分析

从四川省某规模化养猪场病死猪肺脏分离得到1株嗜麦芽寡养单胞菌,分析其生物学特性,为临床鉴别诊断和治疗提供参考。观察分离株的染色特点、培养特性,并通过生化试验进行鉴定;测定分离株对小鼠的LD_(50)并进行药物敏感试验,以分析分离株的致病性与耐药性;测序分析分离株16S rRNA基因序列,构建系统进化发育树。结果表明:该分离株的16S rRNA基因序列与嗜麦芽寡养单胞菌的同源性为99%;在TSA琼脂培养基上培养18h后可长成灰白色、光滑的露珠样小菌落,在血琼脂上菌落周围呈现α溶血;对小鼠的致病性试验测得LD_(50)为6.62×10~7 cfu/只;药敏试验发现分离株对多粘菌素B较为敏感,对喹诺酮类、四环素类、头孢类、碳青酶烯类和氨基糖苷类药物均表现为耐药。经鉴定,分离株为嗜麦芽寡养单胞菌,致病性较强,对多种药物耐药。该研究为该菌的临床诊断、选药治疗、疾病控制等奠定了基础。     

鸽源大肠杆菌O157：非H7菌株的致病性和耐药性分析

为查明南京市某赛鸽公棚赛鸽出现腹泻、死亡的致病病原,本研究对采集的病料进行病原分离鉴定,分析致病菌的血清型、生物被膜表型、毒力基因、耐药菌谱,并对分离菌株进行了人工感染试验。研究表明:1)从患病鸽组织、拭子和粪便中分离出的细菌初步诊断为大肠杆菌O157;分离菌株在NA平板上长出白色、光滑的圆形菌落,在CT-SMAC平板上长出紫红色菌落。2)分离菌株的16S rRNA基因序列与大肠杆菌的相似性达98%~99%,命名为E.c.86246。3)血清学试验表明分离菌株为大肠杆菌O157:非H7菌株,动力试验进一步证实其为动力株。4)分离菌株携带tccp1014、eaeA和hly毒力基因,可导致雏鸡胃肠道出现不同程度的功能损伤,甚至导致死亡;其半数致死量为2.0×10⁵ CFU/mL,具有较强的致病性。5)分离菌株携带tetA、tetM、sul2、aadA1和bla_TEM 5种耐药基因,具有较弱的生物被膜形成能力,对四环素、氨基糖苷类等抗菌药物严重耐药,对阿莫西林、氧氟沙星和诺氟沙星敏感。综上,本研究分离的鸽源大肠杆菌O157:非H7菌株,具有动力性,有较强的致病性和一定的耐药性,为大肠杆菌O157的流行病学调查、致病机理分析和抗菌药物的精准施治提供理论依据和数据参考。     

牦牛源地衣芽孢杆菌的分离鉴定

为分离西藏牦牛源地衣芽孢杆菌并研究其生物学特性，为今后开发相关益生菌及其制剂奠定基础，采集西藏牦牛粪便，从粪便中分离培养、纯化病原菌，通过染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增、同源性分析、进化树构建等对分离株进行鉴定且对分离株进行耐药性试验。结果从样品中分离到3株地衣芽孢杆菌，革兰氏阳性杆菌，分别命名为XZ-1,XZ-2,XZ-3。3株分离株生化检测结果一致：可分解甘露醇、淀粉、阿拉伯糖，可还原硝酸盐，V-P试验呈阳性，不能水解明胶，不能产生红色吲哚。分离株16S rRNA PCR扩增产物电泳结果与预期结果一致，长度为1 500 bp左右。3株分离株之间同源性为96.0%～99.9%，与地衣芽孢杆菌分离株的同源性为98.3%～100%;3株分离株与地衣芽孢杆菌处于同一支，而与链球菌其他种属芽孢杆菌处于不同分支。分离株XZ-1对青霉素、氨苄西林耐药，对林可霉素中度敏感，对头孢曲松、四环素、红霉素、恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、阿莫西林敏感；分离株XZ-2对青霉素、氨苄西林、四环素、林可霉素耐药，对氯霉素中度敏感，对头孢曲松、红霉素、恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林敏感；分离株XZ-...     

新疆柳树花变叶植原体分子鉴定

为研究新疆7个地区柳树花变叶病为何种病原物所造成，本研究以分子生物学技术对其进行鉴定。通过CTAB法提取柳树总DNA，对其16S rRNA基因和tuf基因进行PCR扩增，将测序得到的基因片段通过Blast比对、同源性比较，构建系统进化树和16S rRNA虚拟RFLP分析。结果显示，PCR扩增分别获得16S rRNA（1 238 bp）和tuf（824 bp）的片段，证明该病害与植原体有关，将其命名为柳树花变叶植原体（WPP）；16S rRNA序列分析表明，WPP与中国桃黄化植原体（‘Prunus persica’ yellows phytoplasma）、枣疯病（‘Ziziphus jujuba’ witches’-broom phytoplasma）、杏褪绿卷叶植原体（Apricot leaf roll phytoplasma）同源性均为99.68%；16S rRNA虚拟RFLP分析结果表明，WPP与枣疯病株系（GenBank登录号：AB052876）有 99.8%的相似性，虚拟RFLP模式与16SrV-B亚组的参考模式相同，相似系数为1.00，进一步证明WPP为16SrV-B亚组成员。WPP tuf基因与榆树黄化组(EY)同源性达99%以上，系统进化树显示，柳树花变叶植原体与榆树黄化组（16SrV）植原体聚为一枝。柳树花变叶植原体属于16SrV-B、tuf-B亚组。     

牦牛FABP3基因克隆及组织表达谱分析

【目的】 分析牦牛心肌脂肪酸结合蛋白3（FABP3）基因的结构和功能，并检测其在成年牦牛和胎牛中的表达水平，为探究该基因在牦牛育种中的生物学功能提供理论参考。【方法】以美仁牦牛的心脏组织为试验材料，PCR扩增FABP3基因，对得到的编码区序列（CDS）进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR），检测FABP3基因在成年牦牛和胎牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织的表达水平。【结果】牦牛FABP3基因编码区序列长度为402 bp，编码133个氨基酸；蛋白质的高级结构主要是β 转角和延伸链；牦牛FABP3蛋白不存在跨膜区域和信号肽，属于具有一定亲水性的稳定蛋白；牦牛FABP3基因CDS区核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析显示，FABP3基因在牛属动物中具有一定的保守性；系统进化树分析表明，牦牛与野牦牛和瘤牛的亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远。RT-qPCR结果显示，FABP3基因在成年牦牛和胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织中均有表达，但在胎牛肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中的表达水平显著或极显著高于成年牦牛，在成年牦牛肺脏中的表达水平极显著高于胎牛。【结论】克隆了牦牛FABP3基因，探究了FABP3基因在牦牛中的组织表达规律，为进一步研究该基因在牦牛脂肪沉积中的作用提供了基础数据。     

西藏牦牛源大肠杆菌分离株的致病性及遗传进化分析研究

为研究西藏牦牛源大肠杆菌的致病性及其遗传进化情况,了解其与其他动物源大肠杆菌的亲缘关系,采集西藏牦牛腹泻粪便240份,采用微生物学方法对其进行细菌的分离培养、血清型鉴定和致病性研究,并运用分子生物学方法对其进行16SrRNA鉴定、测序和系统发育分析。结果表明:获得的16株牦牛致病性大肠杆菌分离株中:3株与猪源致病性大肠杆菌亲缘关系较近;5株与禽源致病性大肠杆菌亲缘关系较近;2株与犊牛源大肠杆菌亲缘关系较近;4株与牛源大肠杆菌亲缘关系较近;1株牦牛源致病性大肠杆菌单独形成一个较远的分支;1株与痢疾杆菌和人源出血性大肠杆菌亲缘关系较近,可能成为对人类造成潜在危险的病原菌。西藏牦牛源大肠杆菌与牛源、禽源、猪源、人源大肠杆菌的之间亲缘性很近,存在跨种间传播风险。该种西藏牦牛源大肠杆菌动物致病试验表明,致死率高达95%,应引起高度重视。     

新疆地区牛分枝杆菌29个毒力基因的突变分析

为了解我国新疆地区牛分枝杆菌的毒力基因变异情况并初步评估其毒力变化,利用聚合酶链式反应(PCR)检测临床分离的66株牛分枝杆菌的29个毒力基因,经Sanger测序后与标准株AF2122/97和本实验室保存的两株牛分枝杆菌(M.bovis C68004和M.bovis N)进行序列比对,对基因突变情况进行统计,分析基因突变对其编码蛋白功能和结构的影响。结果表明:1)临床分离株与本实验室保存的高毒力菌株M.bovis N毒力基因突变位点具有很高的相似性,在检测的29个毒力基因中,50%以上临床分离株与M.bovis N共有25个基因序列一致;2)临床分离株广泛存在的Mb2958、Mb2982C和Mb1553C基因突变PROVEAN评分均低于-2.5,可能改变其编码的酶催化活性,进而影响细胞壁脂类合成;3)Mb0607、Mb0609、Mb0606、Mb2979C和Mb1214基因突变分别造成哺乳动物细胞入侵蛋白、甲基转移酶和酰基转移酶蛋白二级结构改变,或许对细菌的胞内生存产生影响。综上,本研究筛选出8个关键毒力基因,这些基因的突变可能在新疆地区牛分枝杆菌流行菌株的毒力变化中发挥重要作用;同时,本研究揭示了关键毒力基因的突变特征,为进一步研究牛分枝杆菌遗传多样性及进化规律奠定了基础。     

柠条锦鸡儿根瘤菌及其共生固氮基因多样性

为研究西北干旱地区豆科植物柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)根瘤菌的系统发育地位及共生基因多样性,对从甘肃省分离得到的菌株进行16SrRNA PCR-RFLP和序列分析,构建系统发育树,确定其分类地位,并通过分析共生基因nodA和nifH,确定种群共生类型。结果表明:从柠条根瘤内分离到64株菌,共有7个PCR-RFLP 16SrRNA基因型,主要归属于Ensifer(占分离总数43.8%)、Mesorhizobium(31.2%)、Rhizobium(25%),其中,Ensifer为主要类群,约占34.4%。共生基因nodA和nifH与Ensifer和Mesorhizobium模式菌株同源性较高,与16SrRNA基因确定的根瘤菌分类地位相比,发现部分共生基因与16S rRNA基因确定的分类地位不同,揭示了共生基因横向转移现象的发生。     

西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。     

患爆发性败血症斑点叉尾鮰病原的分离与鉴定

从患爆发性败血症斑点叉尾鮰肝、脾和肾分离到大量形态和色泽一致的细菌。随机挑选5株细菌注射健康斑点叉尾鮰,感染鱼72 h内全部死亡,且患病症状与自然发病症状一致,确认分离株为斑点叉尾鮰败血症的致病菌。依据其菌落形态、生理生化特征,结合其16S rRNA和gyrB基因序列分析,鉴定5个分离株为蜡样芽孢杆菌。用20种抗微生物药敏纸片对分离株进行药敏实验,发现5株菌均对7种喹诺酮类药物、5种氨基糖苷类药物,麦迪霉素,克林霉素和新生霉素敏感,而对2种头孢菌素类药物和复方新诺明有耐药性。     

类乌齐牦牛乳酸脱氢酶基因克隆及组织表达

旨在克隆西藏类乌齐牦牛乳酸脱氢酶(LDHB)基因并检测其组织表达情况,为给进一步研究LDHB在高海拔地区的极端低氧适应性及能量代谢中的调控作用提供依据。结果表明,类乌齐牦牛LDHB基因CDS区全长1 004bp,编码334个氨基酸,存在2处碱基突变,导致密码子分别由AAG→GAG(赖氨酸→谷氨酸)、ATC→AGC(异亮氨酸→丝氨酸);编码蛋白分子质量为36.72ku,为疏水稳定性蛋白,功能预测在糖酵解及氧化还原等过程中发挥主要功能;系统进化树表明,西藏类乌齐牦牛与九龙牦牛、黄牛的氨基酸序列相似性最高,亲缘关系最近,其次为山羊、宽吻海豚、猪、马、羊驼和野生双峰骆驼,与鸡、乌鸦、非洲爪蟾和鲤鱼较远;定量分析显示,LDHB基因在牦牛肺脏中的表达水平显著高于心脏和肝脏,推测该基因与牦牛抗缺氧性状相关。     

酥瓜果实细菌性斑点病的病原鉴定

为明确安徽省淮南市地区酥瓜果实斑点病的病原菌,采用常规平板划线法从酥瓜果实病组织分离细菌,通过生理生化特征、分子生物学特性和致病性试验对其进行鉴定.结果表明,从采集的病果中获得36株菌落形态特征相似的细菌分离物,测试菌株均能诱导烟草叶片产生过敏性坏死.采用牙签刺伤法将测试菌株接种健康酥瓜果实,可导致接种点处产生水浸状病斑.BLAST结果表明,2株菌株的16S rRNA序列分别与短小芽胞杆菌Bacillus pumilus GR-8(CP009108),ATCC 7061(ABRX01000003)的同源性为99.93％和99.58％,2株菌株的 gyrB 基因序列与 B.pumilus C4(CP011109)的同源性达99.39％.基于gyrB基因的聚类分析证实2株菌株与B.pumilus(C4和GR-8)紧密的聚在一个分支.生理生化试验结果进一步显示,该细菌与文献报道的短小芽胞杆菌的生理生化特征相吻合.结合细菌生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因的序列分析,以及柯赫氏法则验证,确定引起酥瓜果实细菌性斑点病的病原为B.pumilus.     

中国奶牛牛支原体流行病学调查分析

为调查中国奶牛养殖地区牛支原体(Mycoplasma bovis)的流行情况,从2013—2019年,在中国6个奶牛养殖区域集约化牧场,通过随机采样收集犊牛鼻拭子1 878份,对样品进行M.bovis分离鉴定,并分析M.bovis阳性率时间分布,空间分布以及犊牛日龄与M.bovis阳性率的关系。结果表明:1)空间上,中国不同奶牛养殖地区,M.bovis阳性率是不同的。其中西北区(38.7%)高于华东区(35.6%)、华北区(33.6%)、华中区(30.8%)、华南区(29.9%)和西南区(27.1%)。2)时间上,2013—2015年M.bovis 阳性率平均值为47.9%,三年间M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。2016—2019年,M.bovis阳性率平均值为21.1%,四年间M.bovis阳性率无显著性差异。2013—2015年M.bovis 阳性率显著高于2016—2019年M.bovis 阳性率(P<0.05)。3)季节上,夏秋季节M.bovis平均阳性率为31.3%,冬春季节M.bovis阳性率平均值为33.9%,不同季节M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。4)通过线性回归分析,表明M.bovis 阳性率与犊牛日龄呈正相关。综上,2013—2019年,中国奶牛养殖地区M.bovis阳性率平均值为32.6%,M.bovis在中国呈长期流行趋势。季节并不影响M.bovis在犊牛中的流行。M.bovis阳性率与犊牛日龄呈线性正相关。本研究丰富了中国奶牛养殖地区牛支原体流行情况数据,从病原学角度为预防和临床用药提供重要的数据支撑。     

猪红斑丹毒丝菌GZ株的分离鉴定及序列分析

2013年11月从广州某猪场发生急性败血症死亡的母猪心脏、肺脏、脾脏分离到1株病原菌,经形态学观察、培养特性、生化特性及16SrRNA、spaA基因测序,确定为猪红斑丹毒丝菌,命名为GZ株。结果表明,该菌株对阿莫西林、利福平、庆大霉素、头孢类抗生素高度敏感,对其他药物广泛耐药,对BALB/c小鼠的致死剂量为1.5×108 cfu/mL。测序结果与NCBI收录的猪红斑丹毒丝菌进行Blast比对分析,16SrRNA基因与不同地区分离自人、蛋鸡、猪、白海雕、野猪、野兔、鼠等动物的同源性为95.9%~99.8%。spaA基因与NCBI收录的分离菌株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.5%,3处发生突变,其中,第36位缬氨酸突变为亮氨酸,第203位异亮氨酸突变为蛋氨酸,第257位亮氨酸突变为异亮氨酸;与1998年和2006年日本1a型Fujisawa株的核苷酸同源性最高,为99.8%,因此确定分离的GZ株为1a血清型。