牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析

根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。     

牛支原体VspX蛋白黏附特性解析

为进一步解析牛支原体(Mgcoplasma bovis)VspX蛋白的黏附特性,采用间接免疫荧光法检测VspX蛋白在M.bovis中的分布,通过黏附试验和抗体黏附抑制试验检测VspX蛋白的黏附性,采用ELISA方法进一步分析VspX蛋白和突变株结合纤连蛋白(Fn)的特性。结果显示,M.bovis VspX蛋白位于M.bovis菌体表面;重组VspX蛋白(rVspX)能黏附到EBL细胞表面,且M.bovis VspX基因缺失突变株(M.bovisΔVspX)体外黏附EBL细胞能力与M.bovis野生株(M.bovis WT)相比显著下降,两个结果说明rVspX蛋白具有黏附特性;并且抗rVspX蛋白单抗能抑制M.bovis黏附EBL细胞,进而证实rVspX蛋白黏附的特异性;此外,rVspX蛋白与Fn呈剂量依赖性结合,且M.bovisΔVspX结合Fn能力与M.bovis WT相比显著下降,证明M.bovis VspX蛋白与Fn为特异性结合,且Fn分布在EBL细胞表面。以上结果表明,M.bovis VspX蛋白是一种具有Fn结合特性的黏附相关蛋白,能通过EBL细胞外基质成分Fn介导其黏附EBL细胞。     

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌（M.bovis）CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100％。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。     

一株高拮抗活性菌株的鉴定及其抗菌活性缺失突变体的获得

本研究以黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌,从大豆植物根际土壤中筛选到一株拮抗活性较高的菌株(D-7),经Rec A基因序列分析,鉴定其为新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)。经PCR检测,该菌株不存在毒性基因BCESM(esmR)和cbl A。致病性分析发现该菌株对苜蓿幼苗和洋葱没有致病性。为了解该菌株的抗菌物质合成相关基因,利用Tn5转座子突变法构建菌株D-7的突变体库,并筛选获得10株对黄瓜枯萎病菌抗菌活性减弱的突变体。对各突变株插入位点分析发现,其中5个突变株的Tn5转座子插入到同一基因,该基因编码葡萄糖抑制的分裂蛋白A(Glucose-inhibited division protein A,Gid A),其余5株突变体的插入位点分别位于不同的基因上,编码的蛋白包括糖基转移酶(Glycosyl transferase)、Ⅱ型分泌系统蛋白(typeⅡsecretion system protein)等,表明菌株D-7的抗真菌能力有多个基因参与。     

鸡场铜绿假单胞菌外毒素 A 基因遗传变异分析

为探究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)毒力因子变异情况，对鸡场分离、鉴定的7株PA分离菌外毒素A(Exotoxin A,ETA)基因进行了遗传变异分析。结果表明，鸡场分离鉴定的7株PA分离菌成熟的ETA结构蛋白基因长1 824和1 839 bp，编码608和613个氨基酸；7株分离菌ETA基因与27株PA参考菌株之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98.9%～100.0%,98.5%～100.0%。7株分离菌成熟的ETA结构蛋白基因共有多处碱基位点发生了变异，其中包括PA-47株第106～110位15个碱基的连续缺失和10处错义突变。7株PA分离菌ETA蛋白共有6种不同的氨基酸变异位点模式；第426位(H)、第440位(H)、第470位(Y)、第481位(Y)、第553位(E)和第558位(W)氨基酸残基均未发生突变，均为有毒形式。本研究结果可为PA致病机理研究提供参考依据。     

牛分枝杆菌CVCC68002全基因组测序与功能分析

【目的】为进一步深入研究牛分枝杆菌CVCC68002基因组特征,致病性和遗传进化关系,为牛分支杆菌感染疾病的预防和深入研究提供参考。【方法】利用Illumina和Pacbio测序技术平台对CVCC68002菌株进行全基因组测序建库,采用生物信息学和系统进化树等方法,对该菌株基因组功能注释、致病性和遗传进化关系进行了分析。【结果】通过分析发现该菌株基因组全长4 357 100 bp,GC含量为65.64%,编码基因达4 145个;在GO、KEGG、COG、NR数据库基因组特征显示其具有高氨基酸和碳水化合物代谢能力。通过PHI,VFDB,ARDC和CARD数据库对其致病性进行相关分析,得到456个毒力基因注释,主要涉及细菌黏附与定殖、细菌逃避宿主免疫防御系统、分泌系统蛋白和转录因子等。并找到相关包括万古霉素,青霉素,多胺类抗生素、异烟肼、吡嗪酰胺、氟喹诺酮等的抗药性基因,另外,外排泵的抗性蛋白注释量显著,推测牛分枝杆菌通过外排抗性蛋白从而达到抗药自我保护的目的。【结论】获得牛分枝杆菌CVCC68002株完整基因组信息,完善系统进化信息,明确了其毒力因子和有效地靶标抗药基因,为后续对该菌株分...     

耐氟喹诺酮类鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶gyrA基因序列分析

取临床分离的对5种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星)均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA。设计引物gyrAF和gyrAR扩增其DNA旋转酶gyrA基因的氟喹诺酮类耐药决定区(QRDR),对PCR扩增产物进行测序及序列分析。与质控菌株相比,9株临床分离耐药株中只有菌株38和60的gyrA基因发生单碱基突变,菌株38的gyrA基因第371位碱基发生C→T突变,菌株60的gyrA基因第350位碱基发生A→C突变,两处突变均位于QRDR内,其余菌株的核苷酸未发生任何突变。菌株38的碱基突变导致gyrA基因第121位氨基酸发生R→C取代,即Arg→Cys;菌株60的碱基突变导致gyrA基因第114位氨基酸发生M→L取代,即Met→Leu。上述结果提示,gyrA基因QRDR突变并非沙门氏菌耐药性产生的主要原因。     

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii 7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56.使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii 7653R中克隆了exo56序列.exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需.盆栽结果表明,ezc56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤.     

水产动物源嗜水气单胞菌药物敏感性及QRDR基因突变分析

为了解临床分离的59株嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性及其靶基因gyrA和parC编码的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变情况。采用纸片琼脂扩散法测定15种抗菌药物对水产动物源嗜水气单胞菌的耐药情况,采用PCR法扩增gyrA和parC,并通过测序分析其靶基因突变情况。结果表明:24株(40.7%)嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中对萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的耐药率依次为40.7%、16.9%、20.3%、8.5%。敏感菌株QRDR靶位点未发生突变,24株喹诺酮类耐药菌株中gyrA基因编码的第83位氨基酸均存在Ser→Ile突变;19株菌parC基因编码的第87位氨基酸也发生突变,其中18株为Ser→Ile突变,1株为Ser→Arg突变,有5株未检测到突变;ParC亚基氨基酸突变的菌株其GyrA亚基均同时发生氨基酸突变。表明临床分离的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药程度不一,其中萘啶酸的耐药最为严重,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星敏感性较高。喹诺酮类耐药菌株GyrA亚基QRDR氨基酸突变,可能是引起萘啶酸耐药的主要原因。临床分离嗜水气单胞菌QRDR区域的突变具有随机性,但靶位点GyrA的Ser83→Ile以及ParC的Ser87→Ile是最主要的突变方式,另外喹诺酮类药物耐药性的产生可能还与其他耐药机制存在关联。     

克雷伯肺炎杆菌2,3-丁二醇合成途径功能基因研究

克雷伯肺炎杆菌2,3-丁二醇合成相关基因形成bud操纵子,其中budB编码乙酰乳酸合成酶,budC编码丁二醇脱氢酶。除了bud操纵子中的基因外,在缬氨酸合成途径中ilvB和ilvI也编码乙酰乳酸合成酶,dhaD、gldA和acyI三个脱氢酶都报道具有丁二醇脱氢酶活性。但是这些基因编码的酶蛋白对菌株合成2,3-丁二醇的贡献并不清楚。本文分别构建了budB、ilvB、ilvI单突变株,和kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因突变株,通过批次发酵实验对这些菌株的生理特性进行了研究。结果显示ilvB和ilvI基因突变对于2,3-丁二醇合成无明显影响,而budB突变株丧失2,3-丁二醇合成能力,表明budB编码的酶蛋白是2,3-丁二醇合成途径中唯一的功能性乙酰乳酸合成酶。kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因缺失突变株合成2,3-丁二醇能力相较于kp-ΔbudC有所下降,但仍然能合成2,3-丁二醇,表明dhaD,gldA和acyI编码的酶蛋白对于2,3-丁二醇合成贡献微弱,同时表明细胞中具有丁二醇脱氢酶功能的醇脱氢酶种类较多。     

中国奶牛牛支原体流行病学调查分析

为调查中国奶牛养殖地区牛支原体(Mycoplasma bovis)的流行情况,从2013—2019年,在中国6个奶牛养殖区域集约化牧场,通过随机采样收集犊牛鼻拭子1 878份,对样品进行M.bovis分离鉴定,并分析M.bovis阳性率时间分布,空间分布以及犊牛日龄与M.bovis阳性率的关系。结果表明:1)空间上,中国不同奶牛养殖地区,M.bovis阳性率是不同的。其中西北区(38.7%)高于华东区(35.6%)、华北区(33.6%)、华中区(30.8%)、华南区(29.9%)和西南区(27.1%)。2)时间上,2013—2015年M.bovis 阳性率平均值为47.9%,三年间M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。2016—2019年,M.bovis阳性率平均值为21.1%,四年间M.bovis阳性率无显著性差异。2013—2015年M.bovis 阳性率显著高于2016—2019年M.bovis 阳性率(P<0.05)。3)季节上,夏秋季节M.bovis平均阳性率为31.3%,冬春季节M.bovis阳性率平均值为33.9%,不同季节M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。4)通过线性回归分析,表明M.bovis 阳性率与犊牛日龄呈正相关。综上,2013—2019年,中国奶牛养殖地区M.bovis阳性率平均值为32.6%,M.bovis在中国呈长期流行趋势。季节并不影响M.bovis在犊牛中的流行。M.bovis阳性率与犊牛日龄呈线性正相关。本研究丰富了中国奶牛养殖地区牛支原体流行情况数据,从病原学角度为预防和临床用药提供重要的数据支撑。     

Cloning and expression of Mycobacterium bovis secreted protein MPB51 in Escherichia coli

The purpose of this study is to clone, identify, and express the mature secreted protein MPB51 from Mycobacterium bovis and to lay a good foundation for the diagnosis of M. bovis, for applying M. bovis vaccine into clinical practice, and for detection of immunity effectiveness. The gene encoding MPB51 was amplified from M. bovis Vallee111 chromosomal DNA by using PCR technique, PCR product was approximately 800 bp DNA segment. Clone vector pGEM-T-51 was successfully constructed by the PCR product that was cloned into pGEM-T vector by using T-A clone technique. pGEM-T-51 and pET28a(+) were digested by BamH I and EcoR I double enzymes. The prokaryotic expression vector pET28a-51 was constructed by using the purified MPB51 gene that was subcloned into the expression vector pET28a(+). Plasmid containing pET28a-51 was transformed into competence E. coli BL21 (DE3). The bacterium was induced by IPTG and its lysates were loaded directly onto SDS-PAGE. An approximately 30 kDa exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The protein was analyzed by using Western-blotting and it had the antigenic activity of M. bovis. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of subunit vaccine and DNA vaccine against bovine tuberculosis. __________ Translated from Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(2): 298–300 [译自: 微生物学报]     

西藏那曲牦牛源多杀巴氏杆菌荚膜分型及其毒力基因检测

为确定2018年7—11月西藏那曲牦牛发病的死亡原因,以安多县、班戈县、聂荣县和色尼区的26头病死牦牛内脏组织为研究对象,利用常规细菌培养法和特异性基因PCR方法,对分离菌进行鉴定,并对其荚膜血清类型、毒力基因以及致病性进行研究。结果表明:纯化得到13株分离菌,分离菌的菌落特征、菌体形态、生化鉴定结果均与多杀巴氏杆菌相符,并扩增出多杀巴氏杆菌特异性基因Kmt-1和16S rDNA,菌株Pm-1和Pm-2的Kmt-1基因序列与印度、伊朗、巴基斯坦、俄罗斯的牛源多杀巴氏杆菌的同源性均达98%以上;13株菌的荚膜分型鉴定结果均为B型;对分离菌进行已知的23种毒力基因检测结果显示,此次分离到的13株菌毒力基因的数量在16～19种,ptfA、fimA等16种毒力基因检出率为100%,tadD、toxA等4种毒力基因检出率为0,且每个地区分离株毒力基因的分布相同;致病性试验中对照组小鼠全部存活,处理组小鼠死亡时间为24～72 h,死亡率为100%,病变主要表现为脾脏、肺脏、肝脏、心脏出血坏死。导致此次那曲地区牦牛发病死亡的原因为荚膜B型多杀巴氏杆菌病,本研究可为该病的防治提供依据,也为下一步预防疫苗的研究提供了优势菌株。     

西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生长特性、耐药性分析

为确定引起西藏牦牛常发多发肺炎的细菌病原体，采集145份西藏牦牛鼻腔粘液，通过病原分离培养、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等方法进行细菌检测；通过OD₆₃₀和pH变化对分离株进行生长曲线测定；采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。结果显示:从145份牦牛鼻腔粘液中分离得到10株牛支原体；分离株菌落形态和生化试验结果均符合牛支原体的生物学特性；通过PCR分别扩增得到238 bp的uvrC特异性基因与1 500 bp 16S rRNA基因。10株分离株间的uvrC特异性基因和16S rRNA基因序列同源性较高，均与国际标准株PG45有高度同源性，uvrC特异性基因序列和16S rRNA基因序列与国际标准株PG45的同源性分别为98.4%~100%和99.1%~99.9%。生长曲线测定表明，分离株在PPLO培养基中培养24 h内为迟缓期，培养42 h后开始进入稳定期，78 h后开始进入衰亡期；3个分离株培养物的平均pH随着培养时间延长不断降低，其中24~42 h期间pH下降最快，随后下降速度减慢，至78 h后几乎不再变化。药物敏感性试验表明，分离株对大环内酯类、氨基糖苷类和林可胺类等药物均存在不同程度的耐药，但对强力霉素和卡那霉素敏感或中度敏感。     

2015—2017年新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药性分析

为完善新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药的相关数据,为多重耐药病源菌的防控提供依据,本研究检测了2015—2017年新疆不同动物源鼠伤寒沙门菌的流行情况、耐药特性及耐药基因携带率。对经选择性培养基和特异性PCR鉴定的不同动物源鼠伤寒沙门菌,通过琼脂稀释法进行环丙沙星等12种抗菌药物的最小抑菌浓度测定,同时采用PCR方法测定耐药基因在鼠伤寒沙门菌中的携带情况。结果表明:从不同动物中共分离获得162株鼠伤寒沙门菌,分离率由高到低依次为宠物(犬和猫)、猪、羊、牛和鸡;药敏试验显示,不同动物源鼠伤寒沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、四环素和氟苯尼考的耐药率80.0%,未检出对阿米卡星和磷霉素耐药的耐药菌株。从不同动物源分离的162株鼠伤寒沙门菌中有159株菌为多重耐药菌株,占98.1%;不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药均以CIP-AMP-TET-FFC-SMZ 5耐谱型为主。经耐药基因分析,不同动物源鼠伤寒沙门菌耐药基因检出率为6.8%～97.4%,未检出blaSHV、qnrD、rmtB和mcr-1基因。综上,鼠伤寒沙门菌在新疆不同动物中流行率高,耐药现象严重,多重耐药菌株较多且耐药基因携带率高,部分不同动物源菌株间具有相同的耐药表型和耐药基因型。应加强畜牧业抗菌药物使用的管理制度,进而控制鼠伤寒沙门菌耐药性的发展趋势。     

多杀性巴氏杆菌分离鉴定及序列分析

旨在了解新疆地区多杀性巴氏杆菌主要流行株的特性。通过病原的分离纯化、PCR扩增及测序,分析8株多杀性巴氏杆菌的血清型,16S rDNA基因、ompH基因和ompA基因的差异。结果表明,3株羊源、2株牛源和1株禽源分离株为荚膜A型,1株牦牛源分离株为荚膜B型,1株标准株为荚膜E型,均具有很强的致病性。分离株与GenBank公布的代表株的16S rDNA基因、ompH及ompA基因同源性分别为93%~100%、93%~100%、98%~100%。ompH基因的ORF氨基酸C端最后10个氨基酸变化较大,分离到5株ompA基因的ORF氨基酸序列N端多出6个氨基酸（M-K-R-I-I-Q）替代原先的起始位置。可见：新疆主要流行株为强致病性的荚膜A型,且有出现变异趋势。     

I群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

[目的]对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征.[方法]采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征.[结果]hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性.fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列.[结论]此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显.     

牛巴贝斯虫DXR酶的结构特征分析

利用反转录PCR方法扩增牛巴贝斯虫陕县株DXR基因,对其推导氨基酸序列进行生物信息学分析。研究牛巴贝斯虫DXR酶的结构,并探讨其是否可以作为磷胺霉素的作用靶点。结果表明：该基因编码框长度为1 152 bp,编码383个氨基酸,与NCBI上公布的美国牛巴贝斯T2Bo株DXR的相似性为97.4%。同源模建表明,DXR酶的三维结构同恶性疟原虫的三维结构相似,与磷胺霉素结合位点氨基酸具有保守性。     

西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。     

2009年河北省小麦叶锈菌群体EST-SSR遗传多样性分析

通过对小麦叶锈菌群体毒性多态性和EST-SSR多态性分析,为河北省小麦抗病品种的培育和合理利用提供依据。利用34个小麦抗叶锈近等(单)基因系和21对EST-SSR引物对河北省唐山、秦皇岛、沧州、保定、石家庄、邢台和邯郸的30个单孢子分离纯化小麦叶锈菌株进行毒性和DNA多态性分析。结果表明:30株小麦叶锈菌菌株间毒性相似性较高,相似系数为0.70~1.00,分子遗传多态性的相似系数为0.80~1.00。部分地理来源相同的菌株聚在同一亚组,表明小麦叶锈菌株地理来源与毒性多态性和遗传多态性有一定的相关性,但毒性多态性和SSR分子多态性相关性不明显。