罗氏沼虾病毒病检测和免疫防治进展

白尾病是一种由诺达病毒(MrNV)及其卫星样病毒(XSV)引起的罗氏沼虾病害,具有蔓延速度快和致死率高的特点,是罗氏沼虾养殖中的主要病害。介绍罗氏沼虾MrNV和XSV的基因组和结构蛋白、病毒检测方法、罗氏沼虾MrNV免疫机制、疫苗研究进展、MrNV病毒样颗粒微粒特性,以及罗氏沼虾健康养殖策略,讨论疫苗在罗氏沼虾病害防治中的作用。     

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒

用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。     

罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究

罗氏沼虾肌肉白浊病(Whitish muscle diseases of Macrobrachium rosenbergii)是近年来流行于罗氏沼虾苗种阶段的严重疾病,该病病原已确定为罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV).作者在病毒超离提纯的基础上,制备了罗氏沼虾诺达病毒兔抗血清,并应用抗罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体2B5,建立了三抗体夹心酶联免疫检测方法(TAS-ELISA).TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以1μg/mL包板,小鼠单抗2B5的工作浓度为1:50000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98ng,对WSSV、TSV及其他细菌感染死亡的罗氏沼虾苗没有非特异性反应.通过对2000-2002年病虾及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20 min对于白浊症状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践.     

罗氏沼虾野田村病毒3种检测方法比较

胶体金免疫层析技术、RT-PCR、RT-LAMP采用的抗体和特异性引物均针对罗氏沼虾野田村病毒的衣壳蛋白和编码基因RNA2。采用这3种方法分别检测罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),结果表明,免疫胶体金检测试纸能快速检测感染罗氏沼虾野田村病毒的幼虾,但灵敏度较低,能用来检测具有疑似病症的样品;RT-PCR和RT-LAMP检测灵敏度都优于免疫胶体金检测试纸,但RT-PCR方法操作步骤繁琐,所耗时间较长,而RT-LAMP方法操作简便、用时短、不需要特殊仪器,在产物中加入核酸染料后检测结果可用肉眼直接判定。因此,RT-LAMP方法更适合基层和现场检测,其相关试剂盒的研发更具有应用前景。     

罗氏沼虾白肉病病原研究初报

为了探明罗氏沼虾白肉病发病原因,特别采集白肉病的典型病虾苗进行细菌分离、除菌组织悬液制备及人工感染试验,结果表明:从罗氏沼虾白肉病病虾的肌肉、肝胰腺中分离到的细菌浸泡感染正常罗氏沼虾苗不能复制疾病。病虾除菌组织过滤液浸泡感染正常虾苗,7d后可发病,并出现典型的白肉病症状,氯仿处理不能破坏病毒的感染力,表明罗氏沼虾白肉病是一种由病毒引起的疾病。     

罗氏沼虾野田村病毒和双顺反子病毒双重RT-PCR检测方法与序列分析

罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV）和双顺反子病毒（M. rosenbergii dicistrovirus, MrDV）是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60 ℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1 μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对病样总RNA的最低检测限为360 fg。引物的特异性检测表明,该检测方法对TSV、WSSV、IHHNV和嗜水气单胞菌TPS 30基因组无交叉反应。对阳性样品的病毒扩增序列分析表明,MrDV RNA依赖性RNA聚合酶编码区序列无变异,MrNV RNA2序列存在较多变异,进化树结果表明2011年长三角的MrNV病毒主要来自于中国基因型和东南亚基因型。该方法的建立为罗氏沼虾病毒性疾病的预防和种苗的繁育奠定了基础。     

罗氏沼虾TRY基因生物信息学及其mRNA表达分析

【目的】分析罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)胰蛋白酶(TRY)基因的生物信息学及其mRNA的表达情况,为深入探究TRY基因的生物学功能和提高罗氏沼虾产量提供参考依据。【方法】利用MegAlign、ProtParam、ProtScale和MLRC等在线软件对罗氏沼虾TRY基因进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测其在罗氏沼虾腹部神经、胃、心脏、鳃、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道等8个组织中的表达情况,进一步分析TRY基因在罗氏沼虾生长快速家系(FG)和生长慢速家系(SG)个体肌肉组织中的表达规律。【结果】罗氏沼虾TRY氨基酸序列与刀额新对虾(Metapenaeus ensis)TRY氨基酸序列的同源性最高,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)TRY氨基酸序列的同源性最低。罗氏沼虾TRY蛋白的分子量为28.54 kD,理论等电点为4.44,属于疏水性蛋白。罗氏沼虾TRY蛋白二级结构中α-螺旋占17.67%,延伸链占21.05%,无规则卷曲占61.28%。罗氏沼虾TRY基因在所检组织中均有表达,在雌性和雄性个体的肝胰腺组织中均高表达,而在雌性个体的鳃和雄性个体的肌肉组织中低表达。此外,罗氏沼虾TRY基因在FG个体肌肉组织中的表达量极显著高于在SG个体肌肉组织中的表达量(P0.01)。【结论】罗氏沼虾与刀额新对虾的亲缘关系最近;TRY基因在罗氏沼虾各组织中均广泛表达,以在雌、雄罗氏沼虾肝胰腺组织中表达量最高,且存在性别差异性。TRY基因在罗氏沼虾生长发育过程中发挥了重要作用,可能正向调控罗氏沼虾的生长发育。     

罗氏沼虾白尾病研究进展

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是重要的淡水养殖虾类,其养殖主要集中在亚洲国家,仅中国罗氏沼虾的养殖年产量就占全球总产量的50%以上。虽然罗氏沼虾具有相对较强的抗病能力,但近年由于养殖密度过大、水环境恶化等原因,导致罗氏沼虾养殖过程病害问题时有发生,其中白尾病对罗氏沼虾幼苗期造成的危害较大。综述了罗氏沼虾白尾病的病原及传播、检测技术和免疫预防等方面的研究进展。     

池养罗氏沼虾生长缓慢原因初步分析

通过调查分析池养罗氏沼虾的生长状况、主要病原感染情况、遗传多样性、水质以及感染WSSV罗氏沼虾生长存活试验,探讨池养罗氏沼虾生长缓慢原因。结果表明:2016年生长正常与生长欠佳两类池塘平均有效等位基因介于0.632 2~0.687 2之间,平均多态信息含量介于0.583 1~0.635 4之间,属于高度多态性,两种生长类型池塘罗氏沼虾各遗传参数指标和水质指标间均无显著性差异(P0.05);生长正常池塘罗氏沼虾在养殖50、100和150 d,体长、体质量等指标均显著高于生长欠佳池塘罗氏沼虾(P0.05),EHP、WSSV和IHHNV阳性检出率均显著低于生长欠佳池塘(P0.05),养殖220 d,两类池塘各生长状况指标无显著性差异(P0.05),两类池塘沼虾携带上述病原的阳性检出率显著高于前3次检疫结果(P0.05),同时生长正常池塘阳性检出率更高,雄虾数量更少,与2014、2015年调查塘干塘起捕前结果类似;人工感染WSSV罗氏沼虾,感染15、30和45 d,各浓度组生长状况指标存在显著性差异(P0.05),各生长状况指标均随着感染浓度的上升逐步降低。据此结合养殖中后期每隔10 d左右捕大留小的生产工艺,认为水质、种质差异或退化引起池塘罗氏沼虾生长缓慢可能性很小,而感染特定病原引起罗氏沼虾生长缓慢的可能性较大,且感染特定病原对雄虾生长的影响可能大于雌虾。     

罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）和十足目虹彩病毒1（DIV1）的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病（WTD）及虹彩病毒病（DIV1D）的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基...     

2种方法提取日本沼虾基因组DNA

以日本沼虾的尾部肌肉为材料,采用苯酚-氯仿法和氯化钠法提取日本沼虾基因组DNA,并对2种方法提取的结果进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增等方法的鉴定。结果表明:2种方法提取的日本沼虾基因组DNA浓度分别为3 165.8和396.5ng/μl,OD260/OD280比值分别为1.76和1.63,均能满足分子生物学研究的需要。     

罗氏沼虾转录组密码子使用偏好性分析

以罗氏沼虾转录组数据为数据来源,通过研究罗氏沼虾转录组的密码子使用参数(如有效密码子的数量和相关密码子碱基的具体组成信息等),并且采用Codon W 1.4.4深入开展了统计和计算。研究结果显示,同义密码子第三位核苷酸和表达基因密码子GC含量均值分别为0.40和0.45。从整体上看,ENC的平均值等于52.72,其中绝大部分的ENC值小于35。采用高频密码子的研究方法获得GAU、GAA、UUU、AAU、CCA等5个高频密码子。通过最优码子分析法确定16个最优密码子,编码10个氨基酸,最优密码子除UUG外均以A/T结尾。而且把它和大肠杆菌、酵母、果蝇以及人类等6种生物的密码子使用频率开展比较,结果表明,与大肠杆菌和果蝇存在较大差异,而与酵母最为接近。研究结果可为罗氏沼虾功能基因和分子育种等提供理论基础。     

日本沼虾卵黄磷蛋白生化性质分析

采用电泳洗脱法从成熟日本沼虾卵巢中提纯卵黄磷蛋白,并初步分析了其生化性质。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示:其相对分子量为458 ku;由3个多肽亚基组成,分子量分别为110 ku,96 ku,89 ku,且三亚基上均有糖辅基的结合;样品缓冲液中β-巯基乙醇的有无并不影响亚基的分离,推测亚基间不存在二硫键。     

罗氏沼虾营养需求的研究进展

总结了近年来国内外关于罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii营养学方面的研究成果,从蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿质元素等方面论述了对罗氏沼虾营养学的研究现状,为罗氏沼虾的科学养殖提供依据。     

罗氏沼虾不同群体线粒体16SrRNA基因的序列变异及其保守性分析

利用PCR技术扩增获得罗氏沼虾广西养殖群体、江苏养殖群体和缅甸原种F13个不同群体共15个个体的线粒体16SrRNA基因片段,测定序列并进行序列同源性比较。结果显示,在得到的401bp长度的基因片段中,3个群体所有个体的核苷酸序列完全一致,序列同源性为100%,该基因在群体内或不同群体间均不存在遗传差异。表明罗氏沼虾的16SrRNA基因是比较保守的序列,在不同群体间的分化程度很低。     

3种虾壳中虾青素提取工艺优化及其抗氧化活性比较

为有效提高虾壳废弃物中虾青素的提取率,以罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、南极磷虾(Euphausia superba)及凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为原料,利用有机溶剂浸提法,通过单因素试验比较3种虾壳中虾青素的提取效果,并对南极磷虾虾壳中虾青素提取工艺参数进行正交优化;利用红外光谱比较虾青素标准品与3种虾壳制得的样品,对样品中虾青素进行定性分析;以VC作为对照,探索3种虾壳中虾青素的抗氧化能力。结果表明:罗氏沼虾、南极磷虾及凡纳滨对虾在以二氯甲烷为提取液,提取温度为30℃,提取时间为2 h条件下可得到最大提取率,南极磷虾虾壳中的虾青素的提取率显著高于凡纳滨对虾及罗氏沼虾虾壳中的虾青素。而料液比对三者中虾青素的提取率的影响效果不同,南极磷虾和凡纳滨对虾在1∶30 g/mL料液比条件下的提取率达到最大值分别为234.72μg/g和172.21μg/g,而罗氏沼虾在料液比为1∶20 g/mL条件下最大提取率为88.69μg/g。南极磷虾虾壳中提取虾青素的最佳条件为料液比1∶30 (g∶mL),提取温度30℃,提取时间2.5 h,此条件下虾青素的提取率明显提高,达到245.01μg/g。红外光谱证明实验所得虾青素与虾青素标准品具有极为相似的官能团振动吸收峰。通过抗氧化实验研究发现,3种虾壳中的虾青素均具有较好的抗氧化活性,其中以罗氏沼虾虾壳中虾青素抗氧化活性为最佳。     

生物絮团在罗氏沼虾育苗中的应用

对罗氏沼虾育苗水体连续添加不同浓度的葡萄糖和定量的枯草芽孢杆菌培育生物絮团,自1日龄幼体培育至仔虾,连续监测水体的氨氮、亚硝酸氮、溶解氧、COD、葡萄糖和生物絮团等浓度;通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析生物絮团中微生物组成,测定出苗率及育成仔虾个体大小。通过27 d室内罗氏沼虾育苗试验发现:各组生物絮团含量无显著差异,应用生物絮团后,葡萄糖终浓度为20 mg/L组的氨态氮和亚硝酸氮明显低于对照组(P<0.05),溶解氧和COD浓度在试验组与对照组之间不存在显著差异。DGGE分析结果和序列测定结果显示,添加葡萄糖和枯草芽孢杆菌制剂产生的生物絮团,条件致病菌气单胞菌属细菌(Aeromonas sp.)显著少于自然产生的生物絮团,并促进水产有益菌芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)的生长。出苗率及生长测定表明,对照组出苗率为32.60%,20 mg/L试验组为60.60%,比对照组高85.90%。对照组仔虾体长平均值为8.193 mm,20 mg/L试验组体长平均值为10.488 mm,比对照组高28.00%。添加一定浓度葡萄糖和枯草芽孢杆菌产生的生物絮团能有效地控制水质和减少有害细菌的生长。     

芝芪菌质对日本沼虾生产性能和机体免疫的影响

[目的]探讨芝芪菌质对日本沼虾生产性能和机体免疫的影响。[方法]将日本沼虾随机分成2组,每组3个平行,每个平行约45尾,一组为对照组,另一组为试验组,在基础日粮中分别添加500 mg/kg芝芪菌质,饲养35 d后测定日本沼虾生长情况和血清溶菌酶、肝胰脏中碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性及肌肉中超氧化物歧化酶活性。[结果]与对照组相比,添加芝芪菌质的试验组日本沼虾的血清溶菌酶、肝胰脏碱性磷酸酶和酸性磷酸酶以及超氧化物歧化酶活性明显增高。[结论]饲喂适量的芝芪菌质能促进日本沼虾的生长和免疫力提高。