表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

口蹄疫病毒VP31基因在昆虫细胞中的表达

研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达

利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒F48E9株和La Sota株F基因在Bac-to-Bac昆虫杆状病毒系统中的表达

将新城疫病毒(F48E9株和La Sota株)F基因插入至杆状病毒转移载体pFastBacTMHT A中,分别构建重组质粒pFastBacHT-F48F,pFastBacHT-LaF,然后转化E.coliDH5α,以LB/AMP±平板筛选阳性重组子并测序。测序正确后转化至E.coliDH10Bac感受态细胞中,经抗性培养和蓝白斑筛选,筛选出白色菌落后,提取重组Bacmids(分别命名为rBacmid-F48F和rBacmid-LaF),经PCR鉴定正确后,将阳性重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞。在昆虫细胞内,重组Bacmid经复制,表达,装配,形成重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实NDV F48E9株和La Sota株的F蛋白均获得正确表达,所表达的重组F蛋白分子量约56 kD,证明在昆虫细胞内表达并部分糖基化,具有良好的免疫原性,为表达F基因并建立适合国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况,将增强型水母绿色荧光蛋白基因(EGFP)与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中,与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒,将其感染Sf9细胞制备P1种子液,同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定,确定P2种子液的病毒滴度达1.14×107pfu/mL。将P2种子液以MOI 5~10接种指数期Sf9细胞,3 d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制备重组E0糖蛋白,研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在Sf9昆虫细胞中的表达

【目的】在Sf9昆虫细胞中表达H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)基因。【方法】用PCR方法克隆H5N1亚型AIVNA基因,定点插入到转移载体pFastBacHTb中,构建重组转移载体pFastBacHTb-NA。将其转化到含有AcBacmid和helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞中,与AcBacmid重组,获得rAcBacmid-NA。提取重组的Bacmid,转染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒vAc-NA。将vAc-NA重新感染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,3~5 d后收集被感染细胞。取转染细胞、感染细胞、破碎感染细胞上清和破碎感染细胞沉淀进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。【结果】通过PCR成功地克隆了1 352 bp的H5N1亚型AIV不含信号肽序列的NA基因;pFastBacHTb-NA和rAcBacmid-NA构建成功。AIVNA基因在昆虫Sf9细胞内得到有效表达,表达产物分子质量约为52 ku,且具有免疫原性。【结论】H5N1亚型AIVNA基因在昆虫Sf9细胞中表达成功。     

水稻瘤矮病毒髓和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）主要内层衣壳蛋白53基因和外层衣壳蛋白鼹基因的重组杆状病毒,将目的基因（S3和S8）分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子（PH）和plO启动子的下游．经酶切和确证性序列测定,将其转化到DHl0Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-58转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Si9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒．结果表明：SD昆虫细胞被侵染72h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明53和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础．     

玉米转Bt基因后代的抗虫性鉴定及其遗传分析

采用田间接虫鉴定与室内PCR扩增，对玉米4个遗传背景，2个不同回交世代转基因材料进行了抗虫性鉴定．结果表明：回交3代、4代转基因材料平均抗虫性与其阴性对照相比达到了显著或极显著水平，外源Bt基因在回交后代中符合孟德尔定律1:1的分离比例．在4个遗传背景共98株含Bt基因的单株中，田间抗虫性表现高抗73株，抗5株，中抗7株，感2株，高感11株，抗虫株率占86．7％．     

RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达

应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP).序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X(rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP).rb-X侵染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞(sf9)24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在"AcMNPV-sf9昆虫细胞"真核表达体系中成功表达.     

通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

 【目的】口蹄疫病毒（FMDV）对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual 中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf 9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒Bac mP12A3C和Bac P12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30 nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。     

绿色荧光蛋白在秋黏虫细胞中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。