螺旋藻藻蓝蛋白在水和磷酸缓冲液中稳定性的对比研究

[目的]为了寻找一种代替磷酸缓冲液的提取溶液,满足尽量保持其活性的要求。[方法]分别用蒸馏水和磷酸缓冲液,采用研磨法提取藻蓝蛋白并保存。[结果]两者提取效果差别不大。但是,水保存的藻蓝蛋白溶液比磷酸缓冲液保存的藻蓝蛋白溶液易分解。[结论]综合试验条件及藻蓝蛋白稳定性影响因素考虑,可确定pH变化为藻蓝蛋白分解的主要原因;蒸馏水可代替磷酸缓冲液用于提取藻蓝蛋白,活性维持时间不超过15d。     

鱼腥藻藻蓝蛋白的提取·分离纯化和抑菌研究

[目的]对鱼腥藻藻蓝蛋白的提取进行优化,并对藻蓝蛋白粗品进行分离纯化、凝胶电泳以及抑菌作用研究。[方法]采用反复冻融法提取藻蓝蛋白,液相色谱分离纯化藻蓝蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白质成分,并利用96孔板法培养、酶标仪浓度检测,进行抑菌作用研究。[结果]藻蓝蛋白提取的最佳条件为固液比1∶1 g/ml,冷冻时间60 min,硫酸铵饱和度为60%。藻蓝蛋白的最大吸收光是620nm。高效液相色谱分离得到3种蛋白质,标记为PC-1、PC-2、PC-3。SDS-PAGE电泳可知,PC-1和PC-2的分子量在14～18 kD。PC-2对苏云金芽孢杆菌和藤黄叠球菌有较弱的抑菌作用。[结论]为鱼腥藻藻蓝蛋白的提取、纯化和性质研究提供了试验依据。     

R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究

为探究R-藻蓝蛋白抗过敏功效,以坛紫菜为原料,通过25%～35%硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 HR两步柱层析获得了高纯度的目的蛋白（A620/A280〉6.0）.SDS-PAGE显示,该蛋白质由分子质量为17.7 ku和20.5 ku的两个亚基组成,紫外可见分光光度法测得其在620 nm、555 nm有两个特征吸收峰,可确认其为R-藻蓝蛋白.热稳定性和pH值稳定性实验结果显示,R-藻蓝蛋白在低于35℃、pH=4.0～9.0条件下光谱性质相对稳定.动物实验结果表明,100μg/mL高纯度R-藻蓝蛋白能够显著降低小鼠血清中IgE水平;细胞实验结果表明,40μg/mL R-藻蓝蛋白能够降低细胞因子IL-4、IL-13的蛋白质分泌量;基因表达量分析结果显示,R-藻蓝蛋白能够降低IL-4在淋巴细胞中的表达量.可见,坛紫菜R-藻蓝蛋白通过促使CD4＋T cell向TH1型转化发挥抗食物过敏活性.     

不同冻融条件对破壁提取巢湖水华新鲜蓝藻中藻蓝蛋白的影响

[目的]研究不同冻融条件对破壁提取巢湖水华新鲜蓝藻中藻蓝蛋白的影响,为后续提取纯化试剂级藻蓝蛋白提供支持。[方法]在各种条件下,冻融破壁后,利用粗提液中藻蓝蛋白即PC纯度和得率为评价指标,研究不同冻融次数、不同含水率和不同冻融介质对藻蓝蛋白提取效果的影响。[结果]粗提液中PC纯度随着冻融次数的增加而依次减小,PC得率随着冻融次数的增加呈现下降的趋势;PC纯度和得率随着含水量的增大呈现先持平后降低的趋势;在不同冻融介质的试验中,通过比较得出最优的冻融介质为浓度0．0025mol／L的PBS缓冲溶液。[结论]对于冻融储存时间较长的巢湖新鲜蓝藻,最优的试验条件是选用浓度为0．0025mol／L的PBS缓冲液作为冻融介质,在含水率为96．O％～97．5％区间冻融次数仅需1次,即可得到最优的PC的纯度和得率。     

磷酸盐缓冲液的浓度和pH对革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽分级盐析的影响

[目的]探讨磷酸盐缓冲液的pH和浓度在分级盐析时,对革胡子鲶肠道各组分蛋白/肽的影响。[方法]以不同浓度和pH的磷酸盐缓冲液作为组织匀浆缓冲液,在硫酸铵饱和度为20%、40%、60%、80%和100%的条件下,对革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽进行分级盐析,并对盐析产物进行称重、电泳检测和抑菌活性分析。[结果]磷酸盐缓冲液的pH为6.0或7.4时,其浓度对盐析产物产量、蛋白沉淀和抑菌效果无显著影响。而pH为8.0、浓度为0.05 mol/L时,硫酸铵饱和度为60%和100%的粗蛋白/肽的产量显著高于浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液粗蛋白含量;大分子蛋白能更好地在硫酸铵饱和度为20%和40%时沉淀下来,而在饱和度为60%、80%和100%能获得分子量相对较小的抗菌蛋白/肽。磷酸盐缓冲液的pH和浓度对抑菌效果无显著影响。[结论]pH8.0,浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液更适于革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽的提取。     

不同试验条件对藻蓝蛋白提取效率的影响

以实验室培养的水华蓝藻单种[铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa,M.A)、水华微囊藻(Microcystis flos-aquae,M.F)、惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii,M.W)、鱼腥藻(Anabaena sp,A.s)]以及野外新鲜水华蓝藻为研究对象,通过设置不同细胞破碎方法和提取剂种类,筛选并优化藻蓝蛋白荧光分析法的前处理技术。结果表明,冻融试验中,冷冻温度与提取剂添加顺序对蓝藻细胞破碎率无显著影响;以去离子水为提取剂时,冻融2次即可达到最佳破壁条件;在冻干试验中,蓝藻真空抽滤在滤膜上能提高蓝藻细胞的破碎率;综合比较冻融和冻干,后者对蓝藻细胞的破碎效率高于前者;对比3种提取剂对藻蓝蛋白的提取效率,去离子水对藻蓝蛋白的提取效率最高。     

发状念珠藻POD和EST同工酶研究

[目的]通过分析野生的和液体培养的发状念珠藻的过氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶,了解其在遗传物质表达和生理代谢方面存在的差异。[方法]采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对野生的和液体培养的发状念珠藻细胞的POD和EST同工酶进行分析与比较。[结果]POD同工酶谱分析表明,野生发状念珠藻细胞有4条带,其Rf值分别为0.400、0.709、0.764和0.929;液体培养的发状念珠藻细胞只有2条带,其Rf值分别为0.736和0.929。EST同工酶谱分析表明,野生发状念珠藻细胞有2条带,其Rf值为0.397和0.559;液体培养的发状念珠藻细胞有3条带,其Rf值分别为0.296、0.397和0.458。[结论]野生的与液体培养的发状念珠藻细胞在POD和EST电泳图谱上存在一定差异,以野生发状念珠藻的POD同工酶酶谱带数多,酶活性强。     

太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化

为利用太湖打捞蓝藻的蛋白质资源,采用冻融破壁、絮凝、盐析、透析、双水相萃取等方法制备荧光试剂级藻蓝蛋白。研究结果表明,以水为介质冻融2次破壁,将冻融藻浆中蓝藻干物质调节为0.95%,用浓度为7.5g/L的聚合氯化铝絮凝初分离,所得藻蓝蛋白纯度(A6 20/A280)为0.31;采用20%、50%饱和度的硫酸铵两步盐析可将其纯度(A620/A280)提高至2.29;盐析后藻蓝蛋白经100 000的透析袋透析,再以140 g/L的聚乙二醇(分子量2 000)和140 g/L的磷酸钾盐萃取纯化,最终纯度(A620/A280)高达4.60,达到荧光试剂级要求。     

Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺研究

[目的]建立Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺方法并验证其放大可行性。[方法]通过对洗脱条件、上样体积以及洗脱流速的优化,确定最佳分离工艺条件;在确定的工艺条件下,将上样体积与柱体积等比例放大。[结果]Q Sepharose FF分离藻红蛋白的最佳工艺条件为:将30 ml坛紫菜提取液加载到8 ml Q Sepharose FF柱上,以1 ml/min的流速使用添加0-0.10-0.35-1.00 mol/L NaCl的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 6.0)分步洗脱,收集0.35 mol/L NaCl溶液洗脱时的色谱峰。在此条件下R-藻红蛋白的回收率和纯度系数(A565/A280)分别为44.3和1.15。按照该工艺,将75 ml藻红蛋白提取液加载到20 ml Q Sepharose FF柱上进行分离,发现分离效果没有发生明显变化。[结论]使用Q Sepharose FF介质能够分离坛紫菜提取液中的藻红蛋白且该工艺易于放大。     

坛紫菜藻红蛋白粗提技术的研究

[目的]快速、有效、大批量地提取藻红蛋白。[方法]以坛紫菜为原料,采用溶胀法、化学试剂法和搅切法3种粗提技术,以藻红蛋白的提取得率、纯度和提取时间为参数对3种方法进行比较。[结果]溶胀法采用0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）浸提9h,藻红蛋白得率为9.71mg/g,纯度（A565/A280）为0.45;化学试剂法在0.100mol/LSDS溶液作用4h时,藻红蛋白得率为24.35mg/g,纯度（A565/A280）为0.22左右;搅切法采用搅切速度18000r/min作用6min,藻红蛋白得率达到23.11mg/g,纯度（A565/A280）为0.30。[结论]综合比较,搅切法提取藻红蛋白效率高,藻红蛋白得率和纯度较好,处理量较大,是一种十分有效的粗提方法。     

乌贼墨中多酚氧化酶的分离及纯化

用pH7.2磷酸提取缓冲液从乌贼墨汁澡提取多酚氧化酶，提取的粗酶液经30%-80%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-SepharoseCL-6B柱层析和SephadexG-150柱层析后，得到纯化的多酚氧化酶，纯化们数为10.78，纯化后的酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别采用银染色和多酚氧化酶活性染色均显示一条电泳带。     

乌贼墨中多酚氧化酶的分离及纯化

用pH7.2磷酸提取缓冲液从乌贼墨汁澡提取多酚氧化酶，提取的粗酶液经30%-80%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-SepharoseCL-6B柱层析和SephadexG-150柱层析后，得到纯化的多酚氧化酶，纯化们数为10.78，纯化后的酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别采用银染色和多酚氧化酶活性染色均显示一条电泳带。     

高效液相色谱法测定酵母粉中硫胺素

[目的]实现企业在肌苷发酵生产中对酵母粉原料质量的评价,为肌苷发酵的控制奠定重要的方法学基础。[方法]将酵母粉经过高温高压并用盐酸提取,通过试验确定高效液相色谱法分离条件并测定硫胺素含量。[结果]采用Hypersil BDS C18色谱柱,紫外检测波长为254 nm;以0.02 mol/L pH 3的磷酸盐缓冲液为流动相,流速1.0 ml/min对提取液进行色谱测定,可以将硫胺素与其他成分有效分离。用0.1 mol/L HCl悬浮后在超声清洗器中振荡10 min混合均匀,然后于121℃高温高压下30 min离心可将酵母粉中的硫胺素充分释放出来。[结论]采用高效液相色谱法测定酵母粉中硫胺素含量,该方法快速、准确,测定结果可做为评价酵母粉质量的指标,对肌苷发酵有重要指导意义。     

乌贼墨多酚氧化酶的部分特性

以乌贼墨为材料，用0.05mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液提取多酚氧化酶（PPO），30%-80%的硫酸铵分级沉淀后通过DEAE-Sepherose CL-6B层析柱分离，合并具有较高酶活性的洗脱液，透析、浓缩后用于酶的特性研究。通过金属离子对该酶活性影响的研究表明，在mmol/L水平，铜离子和铅离子对该酶具有强烈抑制作用，但铜离子在20μmol/L浓度时，对酶却有显著激活作用。在mmol/L水平，Na^ 、K^ 、Mg^2 和Ca^2 对PPO活性无显著影响。在无机阴离子中HSO3^-对酶活性有强烈抑制作用，在10mmol/L时抑制效率达100%，而Cl^-、Br^-、I^-和SO4^2-则对PPO活性无显著影响。     

杀线虫细菌W3胞外体壁降解蛋白酶的纯化及部分特性

[目的]为筛选和开发高效新型生物杀线虫剂提供依据。[方法]以土壤中筛选的1株具有明显杀线虫活性的细菌菌株W3为供试菌种,对其进行发酵培养,采用硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子柱层析等方法从发酵液中分离W3菌株的杀线虫活性成分,并对各活性成分的杀线虫活性进行测定。[结果]W3菌株粗蛋白处理线虫4h后,虫体活动异常,部分虫体静止不动,处理36h后大部分虫体不活动,部分虫体体壁断裂现象,最终所有线虫被完全消解;从发酵液中纯化出1种能降解线虫体壁的胞外蛋白酶,该酶的分子量约为45KDa,其作用的最佳pH值为7～8,最佳温度为45℃。[结论]W3菌株胞外蛋白酶具有明显的杀线虫活性和线虫体壁降解活性。     

氧化铝柱层析从双孢菇菇柄中提取麦角硫因

[目的]探索双孢菇菇柄中麦角硫因的最佳提取工艺条件。[方法]以双孢菇菇柄为原料,采用氧化铝柱层析提取其麦角硫因,考察上样量、洗脱剂组成,以及上样液pH值和洗脱速度等层析操作对麦角硫因回收率和纯度的影响。[结果]最佳提取条件为上样体积20ml,洗脱剂70%乙醇,上样pH值9.0,流速2ml/min。在最佳条件下,麦角硫因回收率91.2%,纯度25.6%。[结论]该研究为双孢菇加工废弃物综合利用提供新的途径及参考。 更多还原     

高聚物型高效液相色谱柱在依替米星发酵液分析中的应用

[目的]建立一种用聚苯乙烯反相色谱柱联用示差检测器高效液相色谱法（HPLC）分析依替米星发酵液的方法。[方法]使用MKF—RP—ETI色谱柱（100．0mm×7．8mm,200．0mm×7．8mm,5μm）,流动相：O．22mol／L醋酸盐缓冲液（pH=6．0）,流速：1ml／min,检测器：示差检测器。[结果]MKF—RP—ETI色谱柱和HPLC—RD法可方便、快速用于分析鉴定依替米星发酵液,依替米星保留时间约为8min。[结论]该方法可方便、快速、高效地用于依替米星发酵液生产、纯化过程中在线检测的分离分析。