普通念珠藻(Nostoc commune Vauch.)藻蓝蛋白的提取

[目的]为普通念珠藻藻蓝蛋白的提取及开发提供试验及理论基础。[方法]以普通念珠藻为材料,比较藻体及细胞的破碎方法、提取液类型及饱和硫酸铵浓度对藻蓝蛋白提取的影响。[结果]结果表明:利用发酵法破碎藻体和细胞,0.05 mol/L的KP缓冲液(pH值7.2)作为提取液,经过30%~50%饱和硫酸铵盐析和DEAE-Toyopeal 650 S离子交换柱层析后,藻蓝蛋白纯度达2.51,最大紫外-可见吸收峰位于616 nm。[结论]普通念珠藻藻蓝蛋白分离提取较为理想的程序为:藻粉→0.05 mol/L KP缓冲液(pH值7.2)浸泡→发酵法破碎细胞→35%~50%饱和硫酸铵盐析→DEAE-Toyopeal 650 S柱层析→较纯的藻蓝蛋白。     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。     

革胡子鲶体表粘液抗菌肽的分离与纯化及抑菌活性研究

[目的]分离纯化革胡子鲶体表粘液抗菌肽,并分析其抑菌活性。[方法]通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-50凝胶层析,对高密度养殖的革胡子鲶体表粘液中的抗菌肽进行了初步的分离及纯化,并分析其抑菌活性。[结果]经Sephadex G-50凝胶层析分离得到2个洗脱峰,经检测这2个洗脱峰对迟缓爱德华氏菌抑制作用最强,对嗜水气单胞菌抑制作用次之,对大肠杆菌的抑制作用最弱;对同种菌而言,洗脱峰2的抑菌效果强于洗脱峰1。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,洗脱峰1显示3条蛋白主带,并以9.5kD的蛋白含量最高,而洗脱峰2中所含蛋白的分子量应小于4.1kD。[结论]为探讨高密度养殖条件下革胡子鲶的抗病机理奠定了基础,同时有望为研制和开发新型的水产饲料添加剂和抑菌药物奠定基础。     

枯草芽孢杆菌CCTCC M207209抗扩展青霉特性研究——活性物质的提取、稳定性与应用

【目的】考察枯草芽孢杆菌CCTCC M207209抗扩展青霉活性蛋白在不同条件下的稳定性,评价其对苹果扩展青霉污染的抑制作用,为该菌的实际应用提供理论依据。【方法】在确定出最佳硫酸铵饱和度的基础上,用50%的硫酸铵饱和度沉淀发酵液中的活性蛋白,将所得粗蛋白用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解,用截留分子质量为8.0～10.0 ku的透析袋透析后,分别在121℃下处理30 min、经不同pH及0.05 mol/L不同金属离子处理8 h和紫外线照射不同时间后,用杯碟法测定其对扩展青霉的抑菌活性;在接种有15μL扩展青霉孢子悬液的苹果上分别接种30μL蛋白提取物、混合液体发酵物、无菌体发酵液和121℃灭菌30 min的带菌体发酵液,28℃培养7 d后,观察各孔处的发病率,并测量接种处病斑直径。【结果】提取发酵液中抗扩展青霉活性蛋白的最适硫酸铵饱和度为50%;粗蛋白提取物的抑菌活性在121℃处理30 min后无减小;pH为7时蛋白稳定性最高,处理8 h后抑菌活性无降低;紫外线照射前3 h,蛋白活性迅速降低,此后变化较小;不同pH和紫外线照射8 h后,蛋白的活性保持率均大于50%;0.05mol/L的Na+和Mg2+对抑菌活性有促进作用,Ca2+、Zn2+和Fe3+则使其完全失活。含菌体(1×108/mL)发酵物能够完全抑制低含量扩展青霉(1.5×105/mL)对苹果的侵染,活性蛋白可将其在苹果上的侵染率降低至55.6%,并可有效抑制其在苹果中的生长。【结论】枯草芽孢杆菌CCTCC M207209所产抗扩展青霉活性蛋白在广泛的pH、紫外线、温度条件下,具有良好的稳定性,能够有效抑制扩展青霉对苹果的侵染,在防治大田及采后苹果贮藏过程中扩展青霉的污染方面,有很好的应用前景。     

2种常见有机氮农药对革胡子鲶幼鱼的急性毒性效应

[目的]探究杀虫双、杀虫单有机氮农药对革胡子鲶(Clarias lazera)仔鱼的毒性。[方法]采用静水式试验方法,将革胡子鲶仔鱼置于不同浓度的2种杀虫剂溶液中72 h并观察其中毒症状,对革胡子鲶幼鱼的急性致毒效应特征以及革胡子鲶幼鱼对杀虫双和杀虫单的安全浓度进行评价。[结果]杀虫双24 h LC50为272.367 mg/L,安全浓度为96.640 mg/L,属于低毒级;杀虫单24 h LC50为59.688mg/L,安全浓度为7.360 mg/L,属于中毒级。[结论]为安全合理地进行人工育苗的水质管理提供了参考。     

鸭肉肌内磷脂水解酶的提取及相关酶系的酶活测定

为了优化肌内磷脂水解酶的提取过程,建立各种鸭肉肌内磷脂水解酶活的测定方法。采用pH 7.5、8.0、8.5的0.1 mol.L-1的Tris-HCl缓冲液提取鸭肉肌内磷脂水解酶,用饱和度范围为0～90%的硫酸铵进行盐析,研究新鲜鸭肉及板鸭中酸性脂肪酶、中性脂肪酶、总磷脂酶、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)的活力。结果表明,肌内磷脂水解酶的最佳pH为8.0,最佳盐析条件为70%饱和度的硫酸铵溶液。透析过后的粗酶液中酸性脂肪酶活略大于中性脂肪酶,磷脂酶活次之。     

革胡子鲶全血培养制备染色体条件探索

[目的]探究革胡子鲶全血培养及染色体制备的条件方法。[方法]革胡子鲶消毒后用含有肝素的一次性注射器采血,采用RP-MI1640全培养基进行体外全血细胞培养。通过对革胡子鲶血液的细胞培养温度、秋水仙素浓度及加入时间、低渗时间及温度等各种条件的筛选,建立起较成熟的革胡子鲶全血细胞的培养和染色体制备的试验方法。[结果]5 ml培养基中加入0.2 ml全血,26℃下培养72h,在结束培养前6 h加入终浓度0.1μg/ml秋水仙素,低渗35 min,可获得较好的染色体分裂相。[结论]结果为进一步研究染色体的结构、遗传变异、基因定位、荧光原位杂交等奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的性质及对魔芋软腐病菌的抑制作用

以枯草芽孢杆菌为试验材料,以魔芋软腐病致病菌胡萝卜软腐欧文氏杆菌属胡萝卜软腐菌亚种(Erwinia carotovora var.carotovora,简称软腐菌)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aure,简称金葡菌)作指示菌,采用抑菌圈法,利用不同浓度硫酸铵盐析分离抗菌蛋白.结果表明,30%硫酸铵处理盐析的蛋白对软腐菌的抑菌活性最高;抗菌蛋白对软腐菌的抗菌活性在室温至60℃处理10 min时无明显影响,70℃处理10min,其活性仅下降17.1%;在pH值5.5～10.0的范围内抗菌蛋白活性无明显变化;经过氯仿处理后抗菌蛋白活性保持最好;胃蛋白酶可降解部分抗菌蛋白.     

球孢链霉菌JK-1抗菌物质的理化特性研究

[目的]明确球孢链霉菌JK-1抗菌物质的基本理化性质.[方法]以稻瘟菌为指示菌,采用菌丝生长速率法分别测定球孢链霉菌JK-1发酵滤液在不同温度、不同酸碱度、蛋白酶K处理和硫酸铵盐析之后的抑菌活性;采用硫酸铵盐析对抗菌物质进行初步提纯,并通过超滤的方法初步测定该抗菌物质的分子量大小.[结果]球孢链霉菌JK-1产生的抗菌物质在高温和蛋白酶K处理的情况下抑菌活性显著降低,在pH2 ～ 11条件下抑菌活性无显著变化,而pH≥11的强碱性条件下抑菌活性显著降低.饱和度为50％的硫酸铵即可将发酵液中的抗菌物质完全沉淀下来,超滤发现其分子量在10 ～ 30 kD.[结论]该研究结果为球孢链霉菌的田间应用及其抗菌物质的分离鉴定奠定了基础.     

革胡子鲶、本地胡子鲶及其杂交种血清转铁蛋白的遗传多态性

用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了革胡子鲶(Clarias gariepinus)、本地胡子鲶(Claris fuscus Lacepede)及其杂交个体F1的血清转铁蛋白(Tf)的多态性。结果表明,3种鲶鱼均出现2个Tf区域,即Tf一区和Tf二区,革胡子鲶在一区的表达量最高,且没有缺失现象;3种胡子鲶受3个等位基因控制,本地胡子鲶出现4种表现型,革胡子鲶与杂交个体只有2种表现型,Tf杂合体基因型均大于纯合体基因型;血清铁浓度:革胡子鲶>杂交个体>本地胡子鲶,铁饱和度:革胡子鲶>本地胡子鲶>杂交个体。说明革胡子鲶具有更强的耐低氧能力,更能适应恶劣环境。     

贻贝抗菌肽的分离纯化

[目的]从贻贝中提取具有抗菌作用的多肽。[方法]以紫贻贝为原料,采用0.5%的乙酸直接提取方式提取抗菌肽,再经过Sephacryl S-100聚丙烯酰胺凝胶色谱进行纯化,收集各馏分并用滤纸片扩散法测定其抗菌活性及对各种细菌的最低抑菌浓度,使用SDS-PAGE测定抗菌肽的分子质量,测定其在100℃条件下不同处理时间和不同pH条件下抗菌活性的变化。[结果]使用0.5%的乙酸作为提取液粗提取抗菌肽具有较高的提取效率,使用Sephacryl S-100纯化抗菌肽,可将抗菌肽纯化为单一物质。分离纯化出的贻贝抗菌肽具有较强的抗菌性,分子质量为5 908,且具有耐高温、耐酸碱的性质。[结论]该研究为抗菌肽的大规模生产奠定了基础。     

马铃薯早疫病菌拮抗微生物的初步研究

[目的]筛选马铃薯早疫病菌拮抗微生物,并研究其抑菌效果,为利用微生物资源更加有效地控制马铃薯早疫病提供依据。[方法]以对峙培养和滤纸片法筛选具有显著抑菌作用的微生物菌株及其胞内物质或发酵产物,用饱和硫酸铵沉淀法分离抑菌物质。[结果]供试真菌和细菌的12个菌株中,11个菌株均有显著的抑菌作用,但大多数菌株的直接抑菌作用强度与其胞内物质或发酵产物之间无明显相关性。枯草芽孢杆菌B309的直接抑菌率和发酵产物的抑菌率均为最高,分别为79.32%和75.22%;B401次之,其直接抑菌率和发酵产物的抑菌率分别为74.85%和72.03%。B309和B401的发酵产物硫酸铵饱和度分别在45%~55%和55%~65%时,获得的蛋白类物质的抑菌率最高,分别为69.34%和63.52%;蛋白类物质的含量也在上述硫酸铵饱和度时最高,B309为28.251μg/ml,B401为23.673μg/ml,非蛋白类物质无抑菌作用。[结论]枯草芽孢杆菌在防治马铃薯早疫病中有很大的应用潜力。     

南极适冷菌Rheinheimera sp.97产抗菌活性物质发酵条件的优化

[目的]优化南极适冷菌Rheinheimera sp.97产抗菌活性物质的发酵条件。[方法]通过单因素和正交试验对南极适冷菌R.sp.97产抗菌活性物质的发酵培养基进行了优化,并通过单因素试验对其发酵条件进行了优化。[结果]菌株R.sp.97产抗菌活性物质的最佳培养基为：蛋白胨3.0g/L,硫酸铵1.0g/L,淀粉2.0g/L,NaCl15.0g/L;最佳发酵条件为：发酵培养基初始pH8,发酵温度10℃,摇瓶装液量30.0%（V/V）,接种量1.0%（V/V）。优化后菌株R.sp.97发酵液的抗菌活性较优化前提高了18.1%。[结论]为研究南极适冷菌R.sp.97的活性物质奠定了基础。     

鱼腥藻藻蓝蛋白的提取·分离纯化和抑菌研究

[目的]对鱼腥藻藻蓝蛋白的提取进行优化,并对藻蓝蛋白粗品进行分离纯化、凝胶电泳以及抑菌作用研究。[方法]采用反复冻融法提取藻蓝蛋白,液相色谱分离纯化藻蓝蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白质成分,并利用96孔板法培养、酶标仪浓度检测,进行抑菌作用研究。[结果]藻蓝蛋白提取的最佳条件为固液比1∶1 g/ml,冷冻时间60 min,硫酸铵饱和度为60%。藻蓝蛋白的最大吸收光是620nm。高效液相色谱分离得到3种蛋白质,标记为PC-1、PC-2、PC-3。SDS-PAGE电泳可知,PC-1和PC-2的分子量在14～18 kD。PC-2对苏云金芽孢杆菌和藤黄叠球菌有较弱的抑菌作用。[结论]为鱼腥藻藻蓝蛋白的提取、纯化和性质研究提供了试验依据。     

苜蓿二胺氧化酶(DAO)的分离纯化

[目的]寻求操作简单、高效的苜蓿二胺氧化酶(DAO)纯化方法。[方法]苜蓿种子黑暗培养3 d,幼苗依次经硫酸铵沉淀,葡聚糖凝胶G-100(sephadex G-100),DEAE-纤维素以及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)层析分离纯化,最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳。[结果]最佳分段盐析的硫酸铵饱和度为20%~50%。经一系列层析分离后酶液比活力达84.67 U/mg,回收率为26%。经非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后,出现1个蛋白质条带,相对分子质量约为110 k Da。而在变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后,出现2个蛋白质条带,相对分子质量约为55和40 k Da。[结论]苜蓿DAO是由2个大小不同的亚基组成的异源二聚体。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析（摘要）

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母其进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

苦瓜种子蛋白的双水相提取及抑菌性研究

筛选优化了聚乙二醇(PEG)/硫酸铵双水相的质量分数、分配系数、回收率等影响因素,得到了苦瓜种子蛋白的最佳萃取条件:在26%硫酸铵、22%聚乙二醇条件下,分配系数最小,达0.089,回收率为96%,得到分子量为35.6 kD和12.3kD的苦瓜纯化蛋白。抑菌试验表明,苦瓜种子蛋白对细菌、真菌均有不同程度的抑制作用,且纯化蛋白的抑菌性大于粗提蛋白。