牛红细胞源抗菌肽的分离纯化与活性鉴定

【目的】分离纯化牛红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs),并对其体外抗菌活性进行初步检测。【方法】以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化抗菌肽,用琼脂糖平板扩散法测定其抗菌活性,并用质谱法测定其分子质量。【结果】牛血液红细胞粗提物经离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性;阳离子峰经RP-HPLC纯化后,共得到4个峰(F1、F2、F3和F4),其对大肠杆菌均具有抗菌活性,F1峰和F3峰对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅F1峰对白色念珠菌具有抗菌活性;经质谱分析,F1峰纯化肽的分子质量为2 562.40 u。【结论】成功地从牛红细胞中分离纯化到了AMPs;F1峰中AMPs的抗菌谱较广,抗菌活性较强。     

土壤链霉菌CaiF1抗菌物质的分离纯化及活性研究(英文)

[目的]从土壤链霉菌CaiF1发酵液中分离纯化抗菌物质,并研究该物质的活性。[方法]采用乙酸乙酯萃取,大孔吸附树脂吸附,硅胶层析和制备型高效液相色谱(HPLC)等分离技术纯化抗菌物质,以金黄色葡萄球菌、白粉病菌为指示菌进行活性研究。[结果]土壤链霉菌CaiF1发酵液中抗菌物质得到分离纯化;该物质在pH2.0-pH10.0、100℃和紫外照射24h条件下抑菌活性几乎不变,对白粉病的防治效果达69.7%。[结论]分离纯化的土壤链霉菌CaiF1抗菌物质具有很好的稳定性,为其结构鉴定和开发应用提供了理论依据。     

土壤链霉菌CaiF1抗菌物质的分离纯化及活性研究

[目的]从土壤链霉菌CaiF1发酵液中分离纯化抗菌物质,并研究该物质的活性。[方法]采用乙酸乙酯萃取、大孔吸附树脂吸附、硅胶层析和制备型高效液相色谱（HPLC）等分离技术纯化抗菌物质,以金黄色葡萄球菌、白粉病菌为指示菌进行活性研究。[结果]土壤链霉菌CaiF1发酵液中抗菌物质得到分离纯化;该物质在pH 2.0～10.0、100℃和紫外照射24 h条件下抑菌活性几乎不变,对白粉病的防治效果达69.7%。[结论]分离纯化的土壤链霉菌CaiF1抗菌物质具有很好的稳定性,为其结构鉴定和开发应用提供理论依据。     

鳄龟不同组织抗菌肽粗提物的初步研究

采用2种不同的方法从诱导后的稚鳄龟组织内分离抗菌肽,其中5%乙酸浸提法成功地分离出了具有抗菌活性的抗菌肽粗提物。此外,还研究了鳄龟体内产生抗菌肽的能力及抗菌效果。     

贻贝凝集素抗-HIV活性研究

分离提取海洋无脊椎动物贻贝(Crenomytilus grayanus)凝集素,考察其抗HIV活性。采用半乳糖-Sepharose 6B亲和层析和Sephacryl S-200层析分离提取贻贝凝集素(Crenomytilus grayanus lectin,CGL),以光镜检查合胞体抑制试验,以ELSA测定HIVp24抗原表达水平。从海洋无脊椎动物贻贝中分离出的凝集素(CGL),为N-乙酰半乳糖胺/半乳糖(GalNAc/Gal)特异性的凝集素。CGL在27.88mg.L-1浓度时,对HIV诱导细胞病变的抑制达50%;在45.70mg.L-1时,对HIV-1复制的抑制达50%;同时在35.12mg.L-1浓度时,对HIV感染细胞融合的阻断达50%。     

海洋动物共附生放线菌分离及拮抗菌筛选

[目的]从舟山常见潮间带海洋动物中分离筛选得到具有产抗菌活性物质的共附生放线菌,采用不同方法测定其抗菌活性和抗菌谱,同时鉴定拮抗菌的分类地位,为研究海洋来源产抗菌物质的菌源提供基础资料。[方法]通过分离纯化技术,从舟山几个潮间带海洋动物中获得放线菌菌株。点种法初筛后获得对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有一定抑菌作用的菌株;酶标仪法定量测定抑菌活性;滤纸片扩散法复筛获得高效拮抗菌株;采用大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠球菌(Monilia albican)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为指示菌测定其抗菌谱。[结果]对典型菌株GP57和GT16进行生理生化、形态学观察及16S r DNA分子鉴定,其均为链霉菌属(Streptomyces),相似度分别为99%和100%,其中GT16鉴定为灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)。[结论]海洋共附生微生物中,海洋放线菌可能是一类很好的产抗菌活性物的菌源,值得更进一步的研究。     

枯草芽孢杆菌XM16分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化

以苹果腐烂病菌等22种植物病原真菌为供试菌,研究了枯草芽孢杆菌XM16无菌滤液的抑菌活性,结果表明,该无菌滤液对供试的植物病原菌具有强烈的抑制作用,抑菌谱非常广。无菌滤液经硫酸铵盐析,然后过Sephacryl S-100HR凝胶柱进一步分离纯化,获得2种不同组分的具强抑菌作用的抗菌蛋白。SDS-PAGE电泳显示,2种蛋白的分子量分别为21kD和30kD。     

链球菌诱导后家蝇幼虫提取物的抗菌活性研究

[目的]为枯草杆菌诱导后的家蝇幼虫提取物在饲料中的应用提供依据。[方法]采用抑菌圈测量法测定链球菌诱导后家蝇幼虫提取物的抗菌活性,分析其对温度、酸碱和离子强度稳定性的影响。[结果]链球菌诱导的家蝇幼虫提取物对细菌的抑菌圈直径为6.55~11.01 mm。诱导组中家蝇幼虫提取物对6种病原菌和工程菌大肠杆菌JM109均有抑制作用,其对革兰氏阳性菌的抑制作用较强。而未诱导组提取物对细菌的抑菌圈直径为6.01~8.01 mm,诱导组的抗菌活性高于未诱导组。抗菌肽样品具有较好的温度稳定性。当pH值为4~10时,抗菌肽样品的抗菌活性均较高,以pH值为8时最高。抗菌肽样品的抗菌活性随离子强度的升高而下降。[结论]抗菌肽的抑菌活性受环境离子强度的影响,与其作用机理有关。     

果蝇抗菌肽基因（Andropin）的原核表达与活性分析

【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌活性试验表明,表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。【结论】重组工程菌表达得到Andropin的融合抗菌肽,且其具有抗菌生物学活性。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析（摘要）

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母其进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

一点红不同溶剂浸提物的抑菌作用

[目的]研究一点红不同溶剂浸提物的抑菌性。[方法]采用甲醇、乙醇、丙酮乙酸乙酯及乙醚5种溶剂提取一点红,并且采用用滤纸片扩散法研究一点红不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌作用。[结果]提取效率顺序为甲醇>乙醇>丙酮>乙醚>乙酸乙酯,而一点红提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用强弱顺序为乙醚>乙醇>甲醇>丙酮>乙酸乙酯。[结论]乙醇浸提一点红的效率较高,抑菌作用较好。     

高产木聚糖酶的紫色红曲霉菌株筛选及酶学性质研究

[目的]筛选紫色红曲霉木聚糖酶,并研究其酶学性质。[方法]采用平板筛选和固体培养方法获得了产木聚糖酶较高的紫红曲霉（Monascus pupureus）533。采用50%~70%硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶层析、DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析和SephacrylS-200凝胶层析进行纯化。最后,研究温度、pH、金属离子和化学物质对酶活性的影响。[结果]经分离纯化后得到相对分子质量约为46.0 kD的木聚糖酶。木聚糖酶最适反应温度为47℃;最适反应pH为5.5,pH稳定范围为4.5~5.5;Ca2＋、Fe2＋、Na＋和Tween 80对酶活力有激活作用;Mn2＋、Tris、EDTA、尿素和SDS对酶活力有抑制作用;Cu2＋和K＋对酶活力影响不大。[结论]该研究筛选到1株高产木聚糖酶的紫色红曲菌株,扩大了产木聚糖酶的菌株范围。     

草鱼肠道抗菌肽的提取及体外抑菌效果初步研究

将新鲜草鱼肠道组织经超声破碎、乙酸浸提后,再经Sephadex G50和Sephadex G25 凝胶柱过滤层析,收集各组分,采用药敏纸片法检测各组分的抗菌活性.收集具有抗菌活性的组分,经Tricine SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后分析获得1条较明显的蛋白带,相对分子质量约为6 200.该抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌均表现出较强的抗菌活性,说明抗菌肽对维持鱼类肠道微生物区系稳定具有重要作用.     

小麦赤霉病拮抗菌P72抗菌物质的分离纯化和性质研究

[目的]研究小麦赤霉病拮抗菌P72的抑菌活性及稳定性。[方法]将Bacillus subtilisP72接种于发酵培养液中,接种量5%,28℃摇床培养48 h后,8 000 r/min,离心10 min取菌株发酵离心所得上清液进行分离纯化、遗传稳定性、热稳定性及酸碱稳定性测定。[结果]P72菌株发酵上清液经过盐析、透析后进行DEAE-52离子交换层析,用0.5 mol/LNaCl溶液洗脱的蛋白对小麦赤霉病菌的拮抗能力最强。SDS-PAGE电泳显示具有抗菌作用的蛋白分子量约为40 kD。经过稳定性的试验测定,该抗菌物质的拮抗活性具有遗传稳定性,在60℃有较高的稳定性,无菌液对酸具有稳定性,在碱性溶液中不具有稳定性。[结论]小麦赤霉病拮抗菌P72对小麦赤霉病菌的拮抗能力较强,抗菌活性较稳定,且热稳定性较好,有广阔的开发前景。     

番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究

[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质。[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌。研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定。[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质。[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础。     

藏紫草化学成分及抑菌活性研究

[目的]研究藏紫草的化学成分及其抗菌活性。[方法]采用浓度95%乙醇冷浸提取藏紫草得到总浸膏(A),依次采用不同溶剂进行萃取,得到石油醚提取物(B)、乙酸乙酯提取物(C)和正丁醇提取物(D),将C通过硅胶柱色谱技术分离纯化,并采用光谱学方法鉴定化合物的结构;用滤纸片法对A、B、C和D进行抑菌活性研究,并用2倍稀释法测定其MIC值。[结果]从C中分离得到5个化合物,分别为β-谷甾醇、齐墩果酸、苯甲酸、阿魏酸和胡萝卜苷。[结论]化合物1～5为首次从该植物中分离得到;A、B、C和D均具有一定的抗菌活性。     

淡水样品中粘细菌的分离·纯化及其抗菌抗肿瘤活性研究

[目的]从黄龙溪水中分离与纯化黏细菌,并研究其抑菌活性和抗肿瘤活性。[方法]通过对细菌的形态特征和生理生化特性的分析来鉴定黏细菌,并通过抑菌圈法与MTY法分析黏细菌次级代谢物的生物学活性。[结果]首次从淡水中成功分离到黏细菌,且该菌属于黏球菌属。该菌的次级代谢物具有抑制痢疾杆菌、副伤寒、表皮葡萄球菌的作用,在一定范围内具有浓度依赖性。同时,粘细菌还具有较好的抗肿瘤活性。[结论]淡水样品同样可以分离出黏球菌,其抗菌活性和抗肿瘤活性在医药和农业上具有良好的应用前景。     

磷酸盐缓冲液的浓度和pH对革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽分级盐析的影响

[目的]探讨磷酸盐缓冲液的pH和浓度在分级盐析时,对革胡子鲶肠道各组分蛋白/肽的影响。[方法]以不同浓度和pH的磷酸盐缓冲液作为组织匀浆缓冲液,在硫酸铵饱和度为20%、40%、60%、80%和100%的条件下,对革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽进行分级盐析,并对盐析产物进行称重、电泳检测和抑菌活性分析。[结果]磷酸盐缓冲液的pH为6.0或7.4时,其浓度对盐析产物产量、蛋白沉淀和抑菌效果无显著影响。而pH为8.0、浓度为0.05 mol/L时,硫酸铵饱和度为60%和100%的粗蛋白/肽的产量显著高于浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液粗蛋白含量;大分子蛋白能更好地在硫酸铵饱和度为20%和40%时沉淀下来,而在饱和度为60%、80%和100%能获得分子量相对较小的抗菌蛋白/肽。磷酸盐缓冲液的pH和浓度对抑菌效果无显著影响。[结论]pH8.0,浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液更适于革胡子鲶肠道抗菌蛋白/肽的提取。