哲罗鲑生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度的ELISA检测

采用柱层析、蛋白免疫印迹和电泳等方法对哲罗鲑(Hucho taimen)的卵黄脂磷蛋白进行研究,并以其鼠抗和兔抗血清为抗体建立了夹心酶联免疫反应(ELISA)对生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度的变化进行检测.结果表明,哲罗鲑卵黄脂磷蛋白分子量在460 ku,并且由3个亚基组成,分子量分别为137.8 ku、84.2 ku和10.8 ku.蛋白免疫印迹表明,卵黄脂磷蛋白抗血清与雄鱼血清无特异性反应,而与雌鱼血清有特异的反应.本研究建立的双抗体夹心ELISA检测灵敏度为7.8 ng/mL,批内变异系数为4.06%,批间变异系数为4.58%,工作范围为30～2 000 ng/mL,在该范围内标准曲线具有良好的线性和重复性.生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度由每年6月份产孵后的最低值573.4 ng/mL升高到12月份的最高值1 918.2 ng/mL,卵黄积累持续期为6个月,整个生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度只出现一个高峰期,表明人工养殖条件下,性成熟哲罗鲑的生殖周期为1年.     

两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）和苯甲基磺酰氟（PMSF）两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测

为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。     

建兰花叶病毒广东分离物TGBp1生物信息学分析及抗血清制备

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花的重要病毒。为对建兰花叶病毒广东分离物运动蛋白TGBp1进行研究,本试验制备了TGBp1多克隆抗血清,将CymMV广东分离物TGBp1基因克隆到原核表达载体中,诱导表达融合蛋白,以其为抗原制备多克隆抗血清,并对TGBp1进行生物信息学分析。结果表明,TGBp1融合蛋白的相对分子质量约为31.5 kD,该融合蛋白以包涵体形式存在;并以纯化的融合蛋白为抗原成功制备了TGBp1多克隆抗血清。Western blot分析表明,该抗血清与融合蛋白有较强的免疫反应;间接ELISA结果显示其效价高达524 288倍。生物信息学分析表明,该蛋白结构特征与已报道的CymMV其他分离物基本一致。本研究所制备的TGBp1多克隆抗血清具有专化性,为该蛋白质的生物学功能研究奠定了基础。     

昆虫卵黄蛋白及其激素调控研究进展

卵黄原蛋白是特异存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动物血液中的一种蛋白,是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。卵黄蛋白为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营养和功能性物质。随着研究的深入,人们发现,卵黄蛋白不仅为胚胎发生提供营养物质,它在生物体内还具有其他的生物学功能。昆虫卵黄蛋白的研究是近年来昆虫生理学和生化学最活跃的领域之一。一、卵黄蛋白的主要理化性质昆虫卵黄原蛋白和卵黄蛋白是一种大分子量的糖脂复合蛋白,约含有1%~14%的糖、6%~16%的脂类及84%的氨基酸,糖类主要为甘露糖,以聚合甘露糖形…     

原核表达牦牛朊蛋白的纯化及其活性测定

以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清。经Western blotting和间接ELISA鉴定,该抗血清可与牦牛重组成熟PrP(23～242)和牛脑组织提取物发生反应,蛋白酶K消化各抗原可消除免疫反应,但不与GST蛋白和E.coli BL21(DE3)的菌体蛋白发生反应,表明该抗血清为抗牦牛重组成熟PrP(23～242)的抗血清,其效价高达1∶12800,并能识别黄牛脑组织中的天然朊蛋白。原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白能有效地刺激免疫动物产生PrP特异性抗体,所制备的抗血清可适用于天然朊蛋白的检测。     

种蛋孵化早期蛋黄蛋白质组学比较分析

卵黄为发育胚胎提供脂肪、蛋白质等营养物质,直接影响胚胎发育。研究旨在探索胚胎发育早期卵黄蛋白质变化,采用2-DE结合MALDI-TOF MS/MS分析孵化0和10 d种蛋卵黄蛋白质组成。共鉴定出代表10种蛋白质的57个蛋白点丰度存在显著差异(P<0.05),其中8个蛋白点仅存在于0 d卵黄;24个蛋白点仅存在于孵化10 d卵黄;另有25个蛋白点共同存在于0和10 d卵黄中,其中9个点丰度上调、16个点丰度下调。首次检测出卵黄膜外层蛋白1存在于胚胎孵化0和10 d卵黄中。2-DE凝胶图像分析表明,39个蛋白质相对分子质量低于其理论值。生物信息学富集分析表明,4种蛋白质与脂质转运和脂质定位有关,2种蛋白质与抗原结合有关。孵化10 d后卵黄差异蛋白主要参与脂质转运以维持胚胎发育。研究结果有助于进一步了解卵黄蛋白质对胚胎发育的调控机理。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子Ⅱ cDNA的克隆与组织表达分析

为了研究胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ,IGF-Ⅱ)在哲罗鲑Hucho taimen生长繁殖过程中所起的作用,根据Gen Bank收录的大西洋鲑IGF-Ⅱ基因开放阅读框序列(NCBI登录号:NM_001123647)设计用于哲罗鲑IGF-Ⅱ开放阅读框扩增的引物,以哲罗鲑肝脏总RNA反转录成的cDNA为模板,利用PCR方法克隆获得哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ基因的长度为645 bp,编码含有214个氨基酸残基的蛋白,该蛋白的相对分子质量为24554,等电点为9.92;哲罗鲑IGF-Ⅱ前肽由信号肽、B、C、A、D、E肽6部分构成;同源性比对和系统进化分析结果显示,哲罗鲑IGF-Ⅱ与鲑科鱼类IGF-Ⅱ核苷酸序列同源性最高,聚为一支,其中与大西洋鲑的IGF-Ⅱ同源性最高(98.6%),该基因在进化过程中有着高度保守的进化特性;用荧光定量PCR技术检测2龄哲罗鲑IGF-Ⅱ基因在不同组织中的表达,结果显示,该基因在肝脏中表达量最高,在心脏、鳃、脾、后肠、头肾、胃中的表达量次之,而在前肠和脑中的表达量最低。     

传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用

为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreas necrosis virus,IPNV)的检测方法,以GenogroupⅠ型的IPNV ChRtm213分离株基因组RNA为模板,利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNV VP3基因序列(711 bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta进行VP3蛋白表达,以纯化的VP3蛋白为免疫原制备鼠抗血清,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对抗血清效价进行测定,并利用间接免疫荧光抗体法(indirect immunofluorescent antibody test,IFAT)和中国不同地区的IPNV分离株,对抗血清识别中国现行IPNV分离株的能力进行免疫学鉴定.结果表明:SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP3蛋白条带单一,相对分子质量约为45000,与理论值相符;抗血清效价分析显示,所制备的鼠抗IPNV VP3血清与IPNV的反应效价为16000,与纯化的IPNV VP3蛋白的反应效价为32000;间接免疫荧光抗体法分析显示,制备的鼠抗血清能够特异性识别中国不同地区的GenogroupⅠ和GenogroupⅤIPNV分离株,且该血清不与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)发生交叉反应,具备较好的特异性.研究表明,本研究中利用原核表达系统表达的IPNV VP3蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IPNV VP3抗血清能够特异性识别中国不同地区的IPNV分离株.     

重组缩胆囊素融合蛋白制备及其免疫原性研究

成功扩增了猪缩胆囊素(CCK)基因C末端片段,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE检测到相对分子质量约为45 000的融合蛋白,最高表达量占菌体总蛋白的40.21%,蛋白可溶性分析表明,融合蛋白主要是以可溶性形式表达. Western-blotting证实,可溶表达的融合蛋白能与CCK-8阳性血清具有良好的免疫反应性. 以纯化后的蛋白为免疫原制备油乳剂疫苗免疫蛋鸡,结果表明,CCK蛋白可在鸡体内引起免疫反应,加强免疫后蛋鸡血清和卵黄中CCK抗体可维持在较高水平. 为了研究含有CCK抗体的蛋黄粉对鸡生长性能的影响,将其作为添加剂饲喂20日龄肉鸡,试验结果表明,饲喂添加100 和300 g/t含CCK抗体蛋黄粉的肉鸡与阴性对照组相比,试验全期体增质量分别提高2.34%、3.80%,采食量分别提高0.91%、2.65%,且对饲料体增质量比无显著影响.     

几种添加剂对哲罗鲑生长和血液生化指标的影响

将哲罗鲑Hucho taimen在室内玻璃钢水族箱中用流水饲养,研究了小肽、柠檬酸、氯化钠和大蒜素对哲罗鲑（6．35g±0．21g）摄食、生长、体成分和血清生化指标的影响。养殖周期为56d,水温9．2—14．1℃。结果表明：在基础饲料中添加质量分数为1％的小肽后,显著提高了哲罗鲑的增重率和特定生长率（P〈0．05）,血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量也显著升高（P〈0．05）,而体成分与对照组差异不大（P〉0．05）;饲料中添加质量分数为0．5％柠檬酸和1．0％氯化钠对哲罗鲑摄食率、增重率和特定生长率影响不显著（P〉0．05）,0．5％柠檬酸组哲罗鲑血清甘油三酯、胆固醇和高密度脂蛋白较对照组显著降低（P〈0．05）;饲料中添加25mg／kg大蒜素显著降低了哲罗鲑的摄食率、增重率和特定生长率（P〈0．05）,鱼体水分升高（P〈0．05）,粗蛋白和粗脂肪降低（P〈0．05）,血清生化指标变化不显著（P〉0．05）。     

利用AFLP技术筛选与哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)性别相关的分子标记

利用AFLP技术,分析比较雌雄哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)之间的遗传差异。采用两个酶切组合,共45对引物组合对雌雄个体进行扩增。结果表明,电泳检测条带清晰丰富,两个酶切组合分别扩增出958和971个位点,多态性比例分别在4.76%～62.26%和6.98%～37.50%,15个位点在雌雄个体中的比例存在很大差异,聚类分析结果显示雌鱼聚在一起,雄鱼聚在一起,未发现雌雄特异位点。研究积累了大量AFLP分析数据,可为哲罗鱼性别的进一步研究奠定基础。     

几种氨基酸对哲罗鱼生长、消化酶活性及血液生化指标的影响

试验旨在研究了低鱼粉含量配合饲料中添加4种晶体氨基酸对哲罗鱼(Hucho taimen)摄食、生长、体成分、消化酶和血液生化指标的影响。试验设1个对照组,4个处理组,处理组分别添加0.5％L-谷氨酸(LGlu)、0.5％L-丙氨酸(L-Ala)、0.5％甘氨酸(Gly)、0.5％L-脯氨酸(L-Pro)。每处理组设3个...     

中草药方剂对哲罗鱼抗氧化能力的影响

哲罗鱼试验组每组60尾,每天按照表3分别投喂添加不同中草药(四种复方及5种单方)的饲料,对照组投喂基础饲料,连续投喂28 d,停食1 d后采集血液(分离血清及红细胞)及肝脏等样品,进行NO含量、NOS活性、SOD活性、MDA含量的测定.结果表明,血清中NO含量与对照组差异不显著,除当归组外NOS含量均有显著升高趋势;肝脏与血清相反,除当归组外NO含量均有上升,除黄芪高剂量组外NOS的活性均下降.血清中SOD酶活性没有明显变化,肝脏中,只有茯苓可以显著升高SOD活性,而红细胞中,黄芪、贯众和方二组可以使SOD活性有明显的升高;除方二、茯苓组,其余实验组均能明显降低血清中MDA的含量;除方五组外其他实验组均能显著降低MDA的含量.结果显示,中草药对哲罗鱼抗氧化能力的影响因药物种类、检测组织和指标而有所不同,但所选中草药均有一定程度增强机体抗氧化能力的作用.     

哲罗鱼研究现状及其可持续发展策略

哲罗鱼是一种名贵鱼类,具有很高的经济价值和学术研究价值。近些年来,其种群数量急剧下降,成为濒危物种。笔者探讨了哲罗鱼生物学特征、资源分布、养殖等方面的研究进展,并提出了哲罗鱼可持续发展策略,旨在为哲罗鱼资源的健康发展提供参考。     

哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育及其与摄食强度的关系

为掌握哲罗鱼Hucho taimen仔稚鱼嗅囊的发育过程及其与摄食强度的关系,对哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育进行了组织形态学观察,研究了嗅囊发育与摄食强度之间的对应关系,描述了各发育时期的时序和形态特征。结果表明:初孵哲罗鱼仔鱼嗅囊上皮未分化,消化道未有食物充塞度;25~26日龄仔鱼仅有少数个体(11.1%)消化道有一定的食物充塞度(1级);27日龄仔鱼多数个体(占66.7%)开始少量摄食,此时嗅囊上皮仍未分化;29日龄仔鱼均摄食,消化道食物充塞度达到2级和3级的个体分别占44.4%和33.3%;30日龄仔鱼嗅囊上皮从嗅囊基部开始分化;42日龄稚鱼上皮分化更加明显,细胞分化加剧,此时嗅囊上皮分化;45日龄稚鱼均强烈摄食,消化道食物充塞度等级均达到5级,此时嗅囊上皮分化完成;55日龄稚鱼嗅囊形成第一个初级嗅板;85日龄稚鱼嗅囊分化完成,通过光镜和电镜观察,嗅上皮细胞可分为6类,即基细胞、支持细胞、纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞、柱状细胞和黏液细胞。本研究结果可为哲罗鱼资源的保护和苗种培育提供理论依据。     

哲罗鱼稚、幼鱼耗氧量和窒息点的初步研究

对三种不同体重规格的哲罗鱼(Hucho taimen)的耗氧率、耗氧量及窒息点进行测定。结果表明,哲罗鱼的耗氧率与体重呈负相关;耗氧量和窒息点与体重呈正相关。水温在13.5～15℃范围内,平均体重(0.67±0.19)g的哲罗鱼平均耗氧率为(0.72±0.08)mg.h-1.g-1,平均耗氧量为(0.48±0.06)mg.h-1.tail-1;平均体重(2.60±0.61)g的哲罗鱼平均耗氧率为(0.60±0.10)mg.h-1.g-1,平均耗氧量为(1.62±0.23)mg.h-1.tail-1;平均体重(61.83±8.44)g的哲罗鱼平均耗氧率为(0.20±0.90)mg.h-1.g-1,平均耗氧量为(12.36±6.14)mg.h-1.tail-1。在13.5～15℃温度范围内,三组哲罗鱼的窒息点分别为2.08、1.92和1.6 mg.L-1;哲罗鱼的耗氧率呈明显的昼夜变化规律,白天耗氧率明显大于夜晚;A1、A2和A3组窒息点分别为2.08、1.92和1.60 mg.L-1。     

养殖密度对哲罗鱼稚鱼生长和存活的影响

试验设置了5个养殖密度,分别为1 000、2 000、3 000、4 000、5 000尾/缸,经过70 d的养殖和观察,发现养殖密度对哲罗鱼稚鱼的存活率、肥满度、特定生长率和变异系数的影响并不显著.各密度组的存活率分别为87.7%、94.25%、92.95%、91.45%和91.12%,肥满度为0.728～0.793,特定生长率平均值为3.11%,体质量变异系数为0.49%～18.73%.研究结果表明,哲罗鱼稚鱼完全可以在较高的养殖密度下进行培育.     

The Post-Embryonic Development of Digestive System and the Demand of Energy of Hucho taimen

With the technology of morphology, histology and nutrition, the characteristics of organ development and the source and demand of nutritional at different stages in post-embryonic （water temperature 3-14℃） of Hucho taimen were discussed. The results showed that the membrane of H. taimen fertilized ovum was ruptured in 30 d, the prototype of U-type stomach was formed, the mouth could open and close freely, and nutrition was supplied from its yolk sac. The membrane ruptured after 8 d, teeth formed, and anus communicated with outsiders. The oropharyngeal cavity, esophagus, U-type stomach, intestine, and anus initially formed in the digestive tube, which nutrition was supplied from the huge yolk sac. The membrane ruptured after 16 d, pancreas and pyloric caeca appeared, larvae could intake and digest exogenous food, fish mixed nutrition, which was from yolk sac and outsiders, mainly depended on endogenous. The membrane ruptured after 24 d, the fish began floating and intaking actively, the fish mixed nutrition which mainly depended on exogenous. The membrane ruptured after 30 d, the yolk sac was completely absorbed, the function and structure of each digestive organs developed consummately, fish was from mixed nutrition into the stage of exogenous nutrition, the nutritional need of juveniles was below 10% fat, level of the optimal protein was 50%.     

野生、人工养殖哲罗鱼生化成分分析和营养品质评价

为了给哲罗鱼的营养价值和人工配合饲料的研制提供科学依据,2001～2003年4～5月、10～11月,利用现代化学分析手段,分别对乌苏里江虎头江段野生的哲罗鱼和人工养殖的哲罗鱼的肌肉、内脏营养成分进行了综合分析与评价,分析结果：色氨酸为第一限制氨基酸(AAS为0．16～0．28,CS为0．10～0．17),其它氨基酸AAS、CS都大于1;EAAI为118．14～176．05,明显高于鳜鱼(62、30)、草鱼(60．59)、鲢鱼(57．59)和鳙鱼(60．87)的肌肉。人工养殖与野生哲罗鱼的氨基酸含量和营养价值无明显差异。