两种双酶切组合在细鳞鱼AFLP体系中的比较分析

采用Tru9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/PstⅠ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼Brachymystax lenok pallas的遗传多样性进行研究,探索适合其AFLP的双酶切体系。每种双酶切组合体系分别选用20对选择性扩增引物进行扩增。结果表明：采用Tru9Ⅰ/EcoRⅠ组合共扩增出了739个位点,其中多态性位点为336个,每对引物组合扩增的位点为21-45,位点多态性百分比为45.47%,平均Shannon氏指数为0.2739;而采用TaqⅠ/PstⅠ组合共扩增出了759个位点,多态性位点为405个,每对引物组合扩增的位点为29-53,位点多态性百分比为53.36%,平均Shannon氏指数为0.3144。表明,对细鳞鱼进行AFLP分析时,TaqⅠ/PstⅠ的酶切体系呈现出更大的多态性,能提供更多的可供分析研究的数据,更适用于细鳞鱼基因组分析。     

三疣梭子蟹雌雄个体遗传差异的SRAP分析

应用三疣梭子蟹SRAP-PCR优化体系,从88个SRAP引物组合中筛选出17个组合对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌、雄个体遗传差异进行分析,共获得146个位点,雌性个体获得139个位点,多态位点比例为69.78;雄性个体检测到129个位点,多态位点比例达79.07。雌性和雄性的Nei''s基因多样性分别为0.2315和0.2682,Shannon''s信息指数为0.3478和0.4026,雌雄个体间的相似系数为0.5959~0.8417,遗传距离为0.1583~0.4041。用TFPGA软件绘制了个体间的聚类图。另外在5个SRAP选择扩增组合中发现了6个位点在雌雄个体间扩增差异较大,其中4个位点显性条带个体为雄性的比例为12.5%~20%;2个位点显性条带个体为雌性的比例为100%。     

运用AFLP技术分析鲤鱼雌雄之间的差异

本文以我国鲤鱼主要养殖品种--建鲤为研究对象,运用AFLP技术分析比较雌雄鲤鱼之间的差异.共使用64对引物组合对雌雄个体进行扩增,从中筛选出9对引物,电泳图谱条带丰富,多态性位点比例高,每对引物检测出的位点数从104-134个不等,平均121.9个,多态位点比例占69.0%-92.3%;9对选择性扩增引物共扩增出1097个片段,其中264个片段(24.1%)为所有雌雄个体共有条带,其余833个(75.9%)为多态性片段;统计分析,共发现18条带在不同性别中出现的比例差异显著.     

哲罗鱼AFLP技术体系建立的研究

以哲罗鱼为材料提取DNA,采用两组限制性内切酶组合酶切基因组,并对酶量、酶切时间、扩增时稀释倍数及镁离子的浓度进行优化,结果表明200 ngDNA用4 U的EcoRI和PstI在37℃酶切4 h后,再分别用4 U的Tru9I和TaqI在65℃酶切4 h后用3 U的T4连接酶连接3 h,进行预扩增,预扩增产物稀释100倍后选择扩增效果最佳,得到了清晰稳定的扩增图谱;并对两组酶切组合的扩增结果进行了比较,结果显示EcoRI、Tru9I酶切组合扩增的条带数要多于PstI、TaqI酶切组合扩增的条带数,但后者的多态性要高于前者。本研究为采用该技术对哲罗鱼基因组的研究提供了参考。     

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）AFLP体系建立的研究

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）是一种优良的冷水性养殖鱼类,为了进行山女鳟养殖群体的遗传管理,本研究构建了山女鳟的AFLP分析体系,试验采用两组酶切组合酶切山女鳟基因组DNA,并对酶量及酶切时间、预扩增模板用量、预扩产物稀释倍数进行了优化。结果表明,100ng DNA用3U的EcoRI在37℃酶切3h后,再分别用3U的TaqI和Tru9I在65℃酶切4h连接效果最佳,取3μL连接产物进行预扩增,将预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,可以得到清晰的扩增图谱;对两组酶切组合进行对比发现,EcoRI-Tru9I组合扩增的条带数多于EcoRI-TaqI组合,但后者的多态性位点比例高于前者。     

AFLP在濒危植物岷江柏中的应用初探

以14个岷江柏野生居群个体为试材,对AFLP分析过程中的影响因子(酶切与连接、预扩增、选择性扩增和银染)进行了研究.筛选出4对扩增稳定且多态性丰富的AFLP引物;得到扩增条带274条,多态性带137条(占50.00%).     

AFLP在濒危植物岷江柏中的应用初探

以14个岷江柏野生居群个体为试材,对AFLP分析过程中的影响因子（酶切与连接、预扩增、选择性扩增和银染）进行了研究.筛选出4对扩增稳定且多态性丰富的AFLP引物;得到扩增条带274条,多态性带137条（占50.00%）.     

唇(鱼骨)基因组AFLP反应体系的建立及优化

以唇(鱼骨)为实验材料,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)的几个关键技术参数进行研究,建立适合于唇(鱼骨)的AFLP反应体系.结果显示-通过DNA的质量、酶的浓度、酶切时间及扩增时稀释倍数等条件的调整,EcoRI、Tru9I酶切组合和PstI、TaqI酶切组合均能够获得清晰可靠的图谱,二者的结果比较显示,EcoRI、Tru9I酶切组合扩增结果的多态性要稍差于PstI、TaqI酶切组合的扩增结果,为利用AFLP标记对唇(鱼骨)基因组进行深入研究打下基础.     

利用AFLP方法筛选中华绒螯蟹性别相关标记

利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术筛选中华绒螯蟹性别相关标记,共使用192对引物组合检测中华绒螯蟹雌、雄和雌雄混合3个基因组池的多态性,共扩增出5 376条多态性条带,平均每对引物组合扩增出28条多态性条带,获得88条雌雄差异条带。利用雌雄各10个个体再次进行AFLP验证,共62条差异条带具有性别差异,包括两种情况:(1)有49条条带在雌性的4～6个个体中存在,在雄性全部个体中缺失;(2)有13条条带在雄性4～6个个体中存在,在所有的雌性个体中缺失;其余的26条没有性别差异性。差异条带经回收、克隆、测序,结果发现有些条带包含多个序列,共得到77条DNA序列,其中31条序列与鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物性染色体DNA部分片段具有同源性,相似区间在22～212 bp不等,其中6条DNA序列与命中序列之间具有生物学相关性。设计特异性的引物在基因组中检测,没有获得性别特异SCAR标记。     

扩增片段长度多态性在蔷薇基因组DNA检测中的应用

采用单酶切和双酶切AFLP技术分别对5种不同蔷薇品种基因组DNA的遗传多态性进行了检测,比较了2种方法的多态性比率。单酶切采用10条人工设计的与接头序列相识别的AFLP选择性引物,用PstⅠ酶切,共获得108个AFLP标记,片段大小在100~2000 bp,得到33个多态位点,多态性位点百分率为30.56%;双酶切采用25对双酶切AFLP引物,在50~600 bp扩增出清晰条带658条,得到182个多态位点,占总扩增带的27.6%。对多态性片段进行统计,计算出不同品种间的相似系数和遗传距离。结果表明:硕苞蔷薇同其它4种蔷薇的遗传距离偏远,且其它四种蔷薇的遗传距离均较近,这与蔷薇品种来源和培育史相符。该研究表明两种AFLP标记均可用于蔷薇品种基因组DNA的遗传多态性的检测,准确评价尚待和其它品种对比研究后确定。     

不同猕猴桃品种雌雄植株的AFLP分析

以猕猴桃(Actinidiaspp.)幼叶为材料提取基因组DNA,从64个引物组合中选取12对引物进行雌、雄集群DNA样品的扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)扩增,再从中选取4对引物进行6对雌、雄DNA样品的AFLP扩增.4对引物共扩增出74个AFLP标记,其中多态性标记为58,多态性标记百分比为78.4%.遗传相似性分析表明,同一品种雌雄样品之间的AFLP电泳图谱表现出一定的差异,但小于不同品种间的差异,而品种间的差异又小于不同种间的差异.同时AFLP多态性初步检测出猕猴桃不同性别在DNA水平上的差异.     

梅根系丛枝菌根真菌AFLP分析

为了解决梅根系共生的丛枝菌根(AM)真菌难以应用形态学鉴定的问题,以巢式PCR的AFLP方法研究梅根系AM真菌DNA多态性。试验采集梅花期的根系样品,应用改良CTAB法提取总DNA,经纯化处理后,应用巢式PCR扩增根系AM真菌基因片段,进行AFLP分析。结果表明,18个梅品种的30个根系样品中,仅有8个样品经巢式PCR后获得纯化的DNA片段,占试验样品数的26.7%;8个样品共得到指纹图谱带24条,各样品平均多态性位点数为3.0个,Nei’s基因多样性为0.4097±0.0848,Shannon信息指数为0.5968±0.0955;利用Nei’s遗传相似性系数聚类,梅品种根系内AMF基因组DNA的聚类类别与梅"品种群"这一分类级别无相关性。该试验为植物根系共生AM真菌DNA多态性研究提供了一种简便的技术。     

东北红豆杉性别相关的AFLP标记研究

利用AFLP技术,运用64个引物组合,检测雌雄东北红豆杉基因组DNA的多态性,筛选与东北红豆杉性别相关的分子标记.其中7对引物组合共提供了11个与东北红豆杉性别相关的分子标记,其中10个与东北红豆杉雌性相关的分子标记,仅1个与东北红豆杉雄性相关的分子标记.     

鳗鲡病原性气单胞菌AFLP分型研究

以32株从养殖鳗鲡分离的病原性气单胞菌为试验材料,采用Biolog自动菌鉴系统对其进行生理生化鉴定,结果表明,有20株被鉴定为嗜水气单胞菌,7株被鉴定为威隆气单胞菌,1株为豚鼠气单胞菌,其余4株未能鉴定到种.为进一步确定20株嗜水气单胞菌和7株威隆气单胞菌的基因型,筛选了2对引物（E-C/M-C,E-C/M-A）分别对这两个菌种进行了AFLP分析.结果表明：20株嗜水气单胞菌中共检测到88个位点,均为多态性位点;7株威隆气单胞菌中共检测到61个位点,其中60个为多态性位点.经UPGMA聚类分析表明：20株嗜水气单胞菌可初步分为3种类型,每种类型之间平均遗传距离为0.449,同一类型内不同菌株的平均遗传距离为0.127;7株威隆气单胞菌可初步分为4种类型,每种类型之间平均遗传距离为0.467,变异范围为0.415～0.525.该结果为鱼类病原菌的DNA分型研究提供了参考.     

柿(Diospyros kaki L.) AFLP标记连锁图谱的构建

以甜柿禅寺丸和涩柿磨盘柿杂交,用获得的F1代分离群体的96个单株为实验材料,以AFLP标记尝试构建柿属植物的AFLP分子标记连锁图谱。先用2个亲本筛选引物,从256对AFLP引物组合中筛选得到了27对多态性好的引物。用筛选得到的27对引物对2个亲本及其F1群体进行AFLP分析,共得到多态性标记447个,其中符合孟德尔定律的标记有400个,占总多态性标记的89.5%。符合1∶1分离比率的多态性标记共有300个,在禅寺丸中得到147个,在磨盘柿中得到153个。符合3∶1比率的多态性标记有100个。用Mapmaker 3.0软件和拟测交策略,分别构建了禅寺丸和磨盘柿的分子标记AFLP连锁图谱。禅寺丸的连锁图谱包括24个连锁群,由149个AFLP标记组成,总图距为2 105.5cM,标记间平均距离为14.1cM。磨盘柿的连锁图谱包括22个连锁群,由181个AFLP标记组成,总图距为2 253.8cM,标记间平均距离为12.5cM。     

基于EST-SSR标记甘薯连锁图谱构建及淀粉性状的QTL定位

【目的】利用分子标记技术,构建甘薯遗传连锁图谱,并分析甘薯淀粉含量性状的QTL位点,为高淀粉含量甘薯种质资源利用及甘薯分子标记辅助育种提供理论和实践依据。【方法】以高淀粉含量品种万薯5号为母本、低淀粉含量品种商丘52-7为父本建立杂交群体,利用EST-SSR标记,采用"双假测交"策略和运用Join Map4.0软件,分别构建双亲遗传连锁图谱,并结合F1(2012、2013年)群体表型数据采用区间作图法对淀粉含量性状进行QTL检测。【结果】利用1 679对EST-SSR引物筛选出的1 045对多态性引物检测F1群体的标记基因型,获得了1 418个标记位点。分别对上述获得的父母本多态性标记进行遗传连锁分析,在LOD≥5.0情况下,分别构建父母本的连锁遗传图谱。采用642个标记的多态性位点构建母本连锁群74个,其中,215个标记位点位于连锁图谱上,占标记多态性位点总数的33.5%。每个连锁群上有2—11个标记位点,连锁群长度在0.6—129.4 cM,图谱总长为3 826.07 c M,标记间平均距离为17.80 c M。属于父本的776个标记位点构建了80个连锁群,共有252个标记位点构建在连锁图谱上,占标记总数的32.5%,每个连锁群上有2—24个标记位点,连锁群长度在2.0—156.8 c M,图谱总长为3 955.0 cM,标记间平均距离为15.7 c M。以F1杂交群体构建的遗传连锁图谱,结合2012年、2013年2个环境,利用QTL作图软件MapQTL5.0,采用区间作图法进行分析,共检测到17个与淀粉含量性状相关的QTL,贡献率在8.4%—40.5%。其中qWsc-1、qWsc-2、qWsc-3 3个QTL位于母本万薯5号连锁群上,且在2年环境中均可检测到;14个QTL位于父本商丘52-7连锁群上,qSsc-1、qSsc-2、qSsc-3、qSsc-4、qSsc-8、qSsc-10、qSsc-11、qSsc-12是在2个环境均检测到的QTL。qSsc-5、qSsc-6、qSsc-7、qSsc-9、qSsc-13、qSsc-14是只在1个环境检测到的QTL。标记GDAAS0603在双亲中和2个环境中均同时检测到,这些环境稳定QTL可用于分子标记辅助选择。【结论】分别构建了亲本EST-SSR分子标记连锁群图谱,丰富了构建甘薯图谱的标记类型,定位了17个与淀粉含量相关的QTL位点。     

红肉桃种质资源的AFLP分析

利用AFLP技术对24份红肉桃和5份白内桃对照品种进行了DNA多态性分析,从64对E 2/M 3引物组合中筛选出6对引物用于扩增基因组DNA.共获得清晰可辨的174个标记.其中多态性标记为108个,多态性检出率为62.1%.UPGMA聚类分析结果显示.在遗传相似系数0.916处,红肉品种与白肉品种分别聚成了两大类(第6类和第7类),说明两类群间存在较明显的差异;红肉桃14、粘核红肉桃、黑桃1、黑桃2、红肉桃2与红肉桃4几个红肉桃品种独自成类.与其他绝大部分品种遗传距离较远.具有独特的基因型,故应作为重点种质保存.     

云纹石斑鱼和赤点石斑鱼杂交子一代线粒体相关基因的母性遗传特征分析

对云纹石斑鱼和赤点石斑鱼及其正反杂交子代的3种线粒体基因(COⅠ、16S rDNA、Cyt b)和核基因Tmo-4c4进行序列分析,其中16S rDNA序列中有明显的插入缺失位点,而其他3个基因序列无插入缺失变异。在12个分析样本中,COⅠ同源序列(387 bp)中共检测到41个核苷酸多态性位点,16S rDNA(529 bp)中有21个核苷酸多态位点,Cyt b(383bp)中有49个核苷酸多态位点。Tmo-4c4(467 bp)有8个核苷酸多态位点。序列差异分析和遗传距离比较结果显示,正反杂交子一代的3个线粒体基因序列与母本基因序列的同源性都为100%,与父本的基因序列同源性分别为COⅠ:90%和89.4%;16S rDNA:96%和96%;Cyt b:87%和87.2%。核基因Tmo-4c4正反交子一代与母本的序列同源性为98.9%~99.6%之间,与父本的同源性为98.7%~99.4%之间,没有明显的遗传差异。以上结果表明了云纹石斑鱼和赤点石斑鱼杂交子一代在3种线粒体基因上严格按照母性遗传的规律,而核基因Tmo-4c4没有明显的遗传偏向性。