广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌耐药性及其整合子—基因盒检测

【目的】检测广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性和整合子—基因盒携带情况,为凡纳滨对虾副溶血弧菌病的防控及该菌耐药分子机制研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法测定副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性;采用PCR检测I、II和III型整合子及I型整合子可变区基因盒的携带情况,并分析菌株整合子—基因盒携带情况与耐药性的相关性。【结果】104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性,其中,对氟苯尼考(FFC)的敏感性最高,敏感率达82.7%;对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲嘧啶(SM2)和复方磺胺嘧啶(SD)的耐药性较强,耐药率达93.3%～100.0%。在2013-2018年,广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌共有20种耐药谱,其中优势耐药谱为SD/SM2/SMM/SMD/SXT/RAD。PCR扩增结果表明,I型整合酶int1基因检出率为64.4%,sul1和qacEΔ1基因检出率分别为25.0%和27.9%。int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株检出率为22.1%。在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株中,有6株检出携带基因盒,基因盒种类包括blaCTX-M-2-aadA1和blaVIM-60-aadA1-aacA。所有菌株均未检出II和III型整合酶基因。int1和qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离菌株中的检出率差异显著(P0.05,下同)。int1阳性菌株对甲砜霉素(TAP)的耐药率显著大于int1阴性菌株,但其余抗菌药物的耐药表型与int1基因无显著相关性(P0.05,下同);头孢拉定(RAD)的耐药表型与blaCTX-M-2和blaVIM-60基因、新霉素(NEO)的耐药表型与aadA1和aacA基因、磺胺类的耐药表型与sul1基因均无显著相关性。【结论】广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考的敏感性最高,可考虑将该抗菌药物作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间相关性也不显著,但I型整合子的流行增加了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性,因此应加强对弧菌整合子—基因盒的监控。     

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌耐药性和耐药基因的检测

【目的】检测广西沿海地区凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及部分相关耐药基因的携带状况,为凡纳滨对虾疾病防控以及副溶血弧菌耐药机制的深入研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法检测30株分离自广西钦州市、防城港市和北海市的副溶血弧菌对12种常见抗生素的耐药性,以PCR方法检测氨基糖苷类耐药基因ant(3")-I、磺胺类耐药基因Sul1、四环素类耐药基因tet(A)和β-内酰胺类耐药基因TEM在副溶血弧菌中的携带状况,通过SPSS软件进行菌株耐药表型和耐药基因的相关性分析。【结果】30株副溶血弧菌对试验药物的敏感率以氟苯尼考最高(96. 7%),其次是链霉素(90. 0%);耐药率以磺胺二甲嘧啶和青霉素G最高(均为96. 7%)。优势耐药谱型是SDM/SMD/PG/AMP和SMD/PG/AMP。PCR检测结果,ant(3")-I、Sul1、tet(A)、TEM基因的检出率分别为6. 7%、43. 3%、0. 0%和13. 3%。受试菌株共包含ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM+、ant(3")-I+Sul1-tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM+5种耐药基因型,其中优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-,各占40. 0%。相关性分析结果,氨基糖苷类、磺胺类、四环素类、β-内酰胺类抗生素耐药表型与对应耐药基因之间均未发现存在显著相关性。【结论】30株广西沿海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考最敏感,对磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐药性最强;受试菌株共包含5种耐药基因型,优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-。菌株的4类抗生素耐药基因与耐药表型之间均未发现存在显著相关性。     

抗菌肽对凡纳滨对虾抗病性和免疫指标的影响

以体质量为(0.163±0.07) g的凡纳滨对虾为研究对象,在饲料中分别添加0.2%,0.5%和1.0%微生物抗菌肽S200,养殖12周以后,分别进行白斑综合症病毒、哈维氏弧菌和副溶血弧菌攻毒,研究饲料中添加微生物抗菌肽S200对凡纳滨对虾攻毒实验结果和免疫指标的影响。结果表明,饲料中添加0. 2%和0. 5%微生物抗菌肽S200可以显著提高凡纳滨对虾攻毒后的存活率和溶菌酶、超氧化物岐化酶活性,当添加量为0. 2%时,凡纳滨对虾感染副溶血弧菌的累计死亡率最低,为10.0%。当添加量为0.5%时,凡纳滨对虾感染哈维氏弧菌和白斑综合症病毒的累计死亡率最低,分别为13.0%和20.0%,感染副溶血弧菌的累计死亡率为40. 0%,溶菌酶和超氧化物岐化酶活性分别为44.35和60.8 U·mg~(-1)prot,比对照组显著提高(P 0. 05)。当添加量为1. 0%时,凡纳滨对虾感染白斑综合症病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的累计死亡率分别为53. 33%,20. 0%和40. 0%,溶菌酶和超氧化物岐化酶活性分别为9.8和50.17 U·mg~(-1)prot,与添加量为0. 5%相比,除了感染副溶血弧菌的累计死亡率相同(都是40. 0%)外,其他各项数据都低,说明过高剂量的微生物抗菌肽S200对凡纳滨对虾对病毒的抵抗力有一定的负面影响,与对照组相比,溶菌酶活性无显著性差异(P 0. 05),感染副溶血弧菌和白斑综合症病毒的累计死亡率较对照组显著提高(P 0. 05)。结果表明,在饲料中添加适量的微生物抗菌肽S200可以提高凡纳滨对虾感染细菌和白斑综合症病毒后的成活率和超氧化物岐化酶、溶菌酶的活性,提高凡纳滨对虾的免疫力,有助于凡纳滨对虾养殖成功。     

凡纳滨对虾Crustin-like基因的克隆及在副溶血弧菌感染条件下的表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33bp)和24bp的3′非翻译区(478～501bp),编码区为444bp,共编码147个氨基酸;对CL蛋白结构及功能的分析表明,该蛋白编码蛋白质含有1个信号肽、1个跨膜螺旋和1个WAP结构域;攻毒试验表明,副溶血弧菌刺激可导致CL基因表达量的明显变化,总体呈现出先降低后升高的变化趋势。【结论】克隆了凡纳滨对虾CL基因的全长,发现其与副溶血弧菌侵入后引发的免疫反应密切相关,可以作为副溶血弧菌感染前期诊断的参考指标。     

凡纳滨对虾CTNNBL1基因克隆及表达分析

[目的]明确CTNNBL1基因在凡纳滨对虾抗病过程中的功能作用,为深入探讨对虾抗病免疫机制提供参考依据.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾CTNNBL1基因(LvCTNNBL1),利用在线软件进行生物信息学分析,并进一步分析其组织表达特征及应答白斑综合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌感染的表达模式.[结果]LvCTNNBL1基因cDNA全长1906bp,其中开放阅读框(ORE)长1692 bp,编码563个氨基酸,含有1个CTNNBL结构域.同源性分析发现LvCTNNBL1蛋白与大型溞(Daphnia magna)同源蛋白的相似度最高,为77%.基于CTNNBL1基因序列的系统发育进化分析结果显示,凡纳滨对虾被聚为无脊椎动物一类,与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂(Apis mellifera)和美洲鲎(Limulus polyphemus)的亲缘关系较近.LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾中呈组成型表达,以在肠道中的表达量最高、表皮中的表达量最低.注射感染WSSV后,LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先下降后上升趋势,在所有检测时间点与对照组间存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异;注射感染副溶血弧菌后,LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先上升后下降趋势,感染后12h内较对照组极显著升高.[结论]LvCTNNBL1基因表达量在病毒和细菌感染时发生明显变化,可能参与了凡纳滨对虾的抗病免疫途径.     

水温骤降后凡纳滨对虾血清中NO、NOS水平及对副溶血弧菌的敏感性

测定了水温骤降后(A组(25→22℃)、B组(25→19℃)、C组(25→16℃)、对照组(25℃))6、24 h凡纳滨对虾Penaeus vannam ei血清中一氧化氮(NO)的浓度、一氧化氮合成酶(n i-tric oxide synthase,NOS)的活性以及溶菌酶活力的变化,并在水温变化后24 h用副溶血弧菌Vibrioparahaem olyticus对对虾进行人工感染,以评价凡纳滨对虾对副溶血弧菌的敏感性。结果表明,水温骤降后6 h,各试验组对虾血清中NO浓度、NOS活性、溶菌酶活力均与对照组差异不显著(P>0.05)。水温骤降后24 h,B组对虾血清中NO浓度显著高于对照组(P<0.05),A、C两组与对照组差异不显著(P>0.05);B组对虾血清中NOS的活性显著高于对照组(P<0.05),C组显著低于对照组(P<0.05),A组与对照组差异不显著(P>0.05);各试验组对虾血清中的溶菌酶活力与对照组差异不显著(P>0.05);用副溶血弧菌人工感染对虾的死亡率C组为58.3%,与对照组(33.3%)存在显著差异(P<0.05)。这说明水温大幅度急剧下降后,凡纳滨对虾血清中的NOS活性、溶菌酶活力下降,因而导致凡纳滨对虾对副溶血弧菌的敏感性升高。     

致病性副溶血弧菌VP0630株的分离鉴定及其对凡纳滨对虾免疫酶活力的影响

为分析天津地区养殖凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei暴发性死亡的原因,采用生理生化法、16S rRNA基因序列分析及AP4套式PCR方法对从患病凡纳滨对虾(体长5～6 cm)肝胰腺中分离得到的优势菌VP0630进行了病原菌分离鉴定和致病性研究,采用注射感染法对凡纳滨对虾进行攻毒试验,试验设对照组和感染组,每组设3个平行,每个平行各30尾对虾,感染组每尾虾注射3×10~7 CFU/mL的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 25μL,分别于注射后3、6、9、12、24、48、72、96 h时,检测凡纳滨对虾体内免疫酶活力的变化情况。结果表明:经鉴定,优势菌株VP0630属于致病性副溶血弧菌,理化特性鉴定概率为99%,pir毒力基因检测呈阳性;注射感染试验显示,对虾96 h时的累积死亡率达78.37%;酶活力检测显示,对照组对虾血清和肝胰腺中溶菌酶(LYS)、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和总抗氧化能力(T-AOC)6种酶活力在0～96 h时无显著性变化(P0.05),而感染组对虾6种酶活力均呈现先升高后降低趋势,血清和肝胰腺中6种酶活力均在6～12 h时显著升高(P0.05),大部分酶活力在72～96 h时降低至对照组水平,仅个别酶活力显著低于对照组(P0.05)。研究表明,副溶血弧菌VP0630株具有较强的致病性,对凡纳滨对虾免疫防御系统有较强的破坏作用。     

溶藻弧菌RseB基因缺失对凡纳滨对虾致病性的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种条件性嗜盐革兰氏阴性致病菌,是水产养殖常见的病原菌。本实验利用OverlapPCR和同源重组技术,构建RseB基因敲除突变株,以研究RseB在溶藻弧菌致病性方面的作用。结果表明,与野生型溶藻弧菌(ATCC17749)相比,RseB基因的缺失提高了溶藻弧菌的生长速度,溶血性下降了约1.6倍。凡纳滨对虾侵染致病性试验结果显示,实验组凡纳滨对虾开始死亡时间推迟约为4h,LT50时间推迟20h小时,RseB基因缺失株对凡纳滨对虾肠道的侵染定殖能力下降2.2倍。这些结果表明,RseB基因对于溶藻弧菌正常的生理功能、溶血性及毒力都有重要作用。S     

鳗弧菌vah1缺失菌株构建及致病性评估

为了构建减毒鳗弧菌菌株,本文通过基因重组和Overlap PCR技术,敲除鳗弧菌中的毒力基因vah1,构建vah1缺失鳗弧菌菌株△vah1,缺失菌株△vah1的生长速率没有变化,溶血活性下降了9.5倍,生物膜形成能力下降。通过感染凡纳滨对虾,得出野生菌株的半数致死量为(3.16±0.8)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株△vah1的半数致死量为(9.77±0.5)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株的半数致死量提高了约3.09倍,在对虾体内的定植能力下降了约3倍左右,对凡纳滨对虾的肝胰腺细胞造成的溶解和空泡化的破坏程度下降了,引起凡纳滨对虾的免疫基因CAT、SOD、PO、LZM、ACP的表达水平低于野生菌株。△vah1鳗弧菌菌株为后续减毒疫苗菌株或抗鳗弧菌特异性免疫增强剂制备奠定基础。     

NT-6 抗菌脂肽对凡纳滨对虾生长性能 及养殖源头弧菌数的影响

为了评价纳豆菌抗菌脂肽对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei）生长的影响和抑制对虾养殖源头弧菌数 的作用效果,在基础饲料中添加0(A0对照组）、50(A1组）、100(A2组）、200 mg/kg(A3组）NT-6 抗菌脂肽,投喂平均体 重为4.10(依0.10）g 的凡纳滨对虾3 周,测量和计算对虾的生长和形态指标以及染弧菌试验前后各试验组和对照组 水体和虾体中副溶血弧菌、溶藻弧菌数,染菌后观察试验组和对照组对虾的死亡情况并计算对虾的存活率。结果表 明,在饲料中添加一定量的NT-6 抗菌脂肽可显著促进凡纳滨对虾的生长和抑制水体和虾体中弧菌的生长,其中A2 组(100 mg/kg）的促生长和抑菌效果最好。     

以2b-RAD技术构建凡纳滨对虾遗传连锁图谱及生长性状QTL定位

【目的】构建凡纳滨对虾高密度遗传连锁图谱,并对生长相关性状进行QTL定位,筛选出生长性状相关候选基因,为后续开展凡纳滨对虾分子标记辅助育种、生长相关功能基因精细定位研究等提供理论依据。【方法】以耐低盐选育凡纳滨对虾为父本,厄瓜多尔野生凡纳滨对虾为母本,单尾交配,以2个亲本及150个F₁代个体为作图群体,通过2b-RAD测序挖掘SNP分子标记并构建遗传连锁图谱;结合生长性状表型数据,使用MapQTL 6.0在构建的遗传连锁图谱上对体质量、全长、体长、头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高等13个生长相关性状进行QTL定位。筛选QTL区间SNP分子标记附近的基因,经GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,挖掘生长相关候选基因;并采用实时荧光定量PCR检测候选基因在凡纳滨对虾不同组织及不同群体间的表达情况。【结果】构建的凡纳滨对虾遗传连锁图谱包括3136个SNPs标记,分布在44个连锁群上;总图谱全长为5430.54 cM,平均图距为1.73 cM。生长性状QTL定位共产生79个生长性状相关QTLs,LOD范围为3.00~11.04,可解释的表型变异范围为9.0%~28.8%。根据GO功能注释及KEGG信号通路富集分析结果,最终筛选出4个生长相关候选基因（TOB2、CRAT、CCT6、KLF4）。4个候选基因在凡纳滨对虾各组织中均普遍表达,且CCT6、KLF4和TOB2基因在耐低盐选育家系群体中的相对表达量均高于常规的凡纳滨对虾群体,其中CCT6基因表达差异达显著水平（P<0.05）。【结论】基于2b-RAD技术构建的凡纳滨对虾遗传连锁图谱鉴定出79个与生长性状相关的QTLs,并筛选出4个与凡纳滨对虾生长性状相关的候选基因（CCT6、KLF4、TOB2和CRAT）。可见,以2b-RAD技术结合QTL定位能高效、快捷挖掘出凡纳滨对虾生长性状相关候选基因,为开展分子标记辅助育种、生长相关功能基因精细定位研究等提供技术支持。     

凡纳滨对虾转录组测序分析及肌肉生长发育相关基因的筛选

【目的】筛选出凡纳滨对虾生长发育的功能基因及代谢调控网络,揭示其生长发育的分子机制,为后续开展凡纳滨对虾分子生物学研究提供宝贵的基因数据来源。【方法】以快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织为研究材料,通过Illumina HiSeqTM2500平台对构建的cDNA文库进行高通量测序分析,以StringTie进行拼接组装后利用DESeq2筛选差异表达基因,并基于KOG、GO、nr、COG、Swiss-Pro、KEGG和Pfam等数据库进行差异表达基因功能注释分析。【结果】经拼接组装共获得53458844条Clean reads,各样品Clean reads的Q30均在93.00%以上;Illumina测序获得的Clean reads与参考基因组的比对效率在87.75%~87.80%,说明转录组测序数据真实可靠。采用SnpEff进行SNP/InDel变异注释分析,结果显示,SNP位点中以A>G、G>A、C>T和T>C等4种类型的数量较多（14950~21562个）,InDel位点则以SYNONYMOUS_CODING的数量最多（33630个）。使用StringTie对Mapped reads（比对到参考基因组的Reads）进行拼接,共发掘到4607个新基因,分别输入COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和nr数据库中进行序列比对,最终发现共有1098个新基因被注释,以被nr数据库注释的新基因数量最多（1077个）,而被COG数据库注释的新基因数量最少（416个）。基于Q-value<0.05且Fold Change>2的筛选条件,共获得1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）;1408个差异表达基因被注释到53个GO功能条目中,其中,22条被注释到生物学过程（Biological process）,16条被注释到细胞组分（Cellular component）,15条被注释到分子功能（Molecular function）;KEGG信号通路富集分析发现3条重要的信号通路,分别是溶酶体通路（Lysosome）、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）及鞘脂类代谢（Sphingolipid metabolism）。在溶酶体通路中,CTSL基因、Nramp基因、MyoG基因和Myf5基因在凡纳滨对虾快速生长群体肌肉组织中呈上调表达,而Trypsin基因呈下调表达。【结论】通过转录组测序分析从快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织中筛选出1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）,主要富集在溶酶体、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢及鞘脂类代谢等通路上,在对虾肌肉生长发育过程中发挥重要作用。     

淡水养殖条件下急性缺氧对凡纳滨对虾表观特征、相关酶活性与基因表达的影响

【目的】深入挖掘凡纳滨对虾应答缺氧胁迫的生理调控机制，为凡纳滨对虾抗缺氧应激新品种的选育提供理论依据，也为营养素调控缺氧应激提供新的作用靶点。【方法】根据水体溶解氧（DO）含量，分别设对照组（5.00 mg/LDO）、低氧组（2.00 mg/L DO）和缺氧组（0.75 mg/L DO），观测急性缺氧胁迫下凡纳滨对虾的表观特征，于胁迫0、2、6、10和14 h采集凡纳滨对虾肝胰腺组织样品，通过ELISA试剂盒检测LDH、GCK、PK、Cyt c、SOD和CS活性，利用RT-PCR扩增HIF1-α、GLUT、BNIP3、p53、c-fos、Kv1.2、PTEN和VEGF等8个基因，并采用实时荧光定量PCR检测缺氧胁迫下的基因表达变化。【结果】急性缺氧胁迫下，凡纳滨对虾频繁游动，摄食量慢或不进食、蜕壳不遂，虾壳呈黄色或红色，生长速度缓慢并逐渐出现死亡。凡纳滨对虾肝胰腺中HIF1-α、GLUT、BNIP3和VEGF基因相对表达量随缺氧时间的延长呈显著上升趋势（P<0.05，下同），Kv1.2和PTEN基因相对表达量呈显著下降趋势，c-fos和p53基因相对表达量则表现为先升高后降低。缺氧组凡纳滨对虾肝胰腺中LDH、PK和Cyt c的活性随缺氧时间的延长呈显著下降趋势，且始终低于低氧组，而GCK、SOD和CS的活性呈先上升后下降趋势。【结论】凡纳滨对虾会通过产生各种生理生化调节策略来抵御急性缺氧胁迫，包括改变机体能量获取方式、增加能量积累、高表达糖代谢或有氧氧化过程的关键酶、抑制血红细胞凋亡、降低机体代谢率、刺激血管生成等，以降低机体对DO的消耗。     

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因（HDAC1）在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSOR...     

海巴戟果提取物对凡纳滨对虾副溶血性弧菌的抑制效应

采用传统煎煮法提取海巴戟果有效成分,以副溶血性弧菌为试验菌株,将抑菌圈直径、最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）及抑菌率作为检测指标,探讨海巴戟果热水提取物对水产动物致病菌的体外抑菌效果。结果表明,海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的生长有抑制作用,其最小抑菌质量浓度（MIC）为25.00 g·L?1,最小杀菌质量浓度（MBC）为50.00 g·L?1。海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的抑菌效果随着紫外照射时长而减弱,甚至消失,煮沸时间≥15 min才能使其更好地发挥抑菌作用。     

猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。     

氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺氨代谢相关指标及细胞凋亡的影响

【目的】探究在盐度3下氨氮慢性胁迫对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）氨代谢和细胞凋亡的影响,以期为凡纳滨对虾免疫机理研究和生产实践指导提供参考。【方法】将480尾初始体质量6.49±0.14 g的凡纳滨对虾分为4个组,6个平行,暴露于0（对照组）、0.9、5.2和12.0 mg/L的氨氮水体中,氨氮胁迫20和40 d后分别统计凡纳滨对虾体质量增长率和存活率,测定凡纳滨对虾血淋巴和肝胰腺中氨代谢相关物质和酶活性、抗氧化酶活性及细胞凋亡相关基因表达量,同时取肝胰腺制作石蜡切片进行Tunnel染色。【结果】随氨氮浓度增加,体质量增长率和存活率逐渐降低,血淋巴氨氮和尿素氮含量逐渐升高,胁迫20 d与胁迫40 d结果相近;肝胰腺谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）和过氧化氢酶（CAT）活性在氨氮胁迫20 d升高,在氨氮胁迫40 d时5.2和12.0 mg/L组酶活性降低;氨氮胁迫20 d,12.0 mg/L组的肝胰腺总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性显著低于对照组（P<0.05,下同）;各胁迫组肝胰腺Cyt C和Caspase-3基因表达量显著高于对照组。TUNEL检测结果显示,细胞凋亡数量随氨氮浓度增加而增加,且氨氮胁迫40 d较20 d更多。【结论】经氨氮慢性胁迫后,环境氨氮扩散到血淋巴中,凡纳滨对虾血淋巴氨氮累积越多,尿素氮含量随之增加,肝胰腺谷氨酰胺合成途径受到抑制,氨代谢受到阻碍,应激产生的活性氧超出抗氧化系统调节范围,对肝胰腺造成损伤,诱导细胞凋亡发生,对凡纳滨对虾生长存活造成不利影响。     

猪源大肠杆菌耐药性及相关耐药基因检测

【目的】 研究新疆阿克苏地区某规模化猪场猪源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药情况及相关耐药基因携带情况,分析耐药表型与耐药基因之间的关系。【方法】 采用琼脂稀释法,对分离鉴定的443株猪源大肠杆菌进行猪场常用6大类13种抗菌药物最小抑菌浓度的测定。采用PCR方法,检测13种抗菌药物相应的4大类10种耐药基因。【结果】 该猪场猪源大肠杆菌对被检的8种抗菌药物耐药率超过70.0%,其中对恩诺沙星、链霉素、大观霉素、金霉素、土霉素的耐药率高达90.0%以上,对阿米卡星、安普霉素、头孢噻呋、多黏菌素E具有较好的敏感性,耐药率未超过25.0%;多药耐药结果以7~9耐为主,占63.6%。除tetK外,对被检的其他9种耐药基因均有检出,以携带floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)耐药基因为主。【结论】 新疆阿克苏地区某规模化猪场猪源大肠杆菌至少对被检的1种抗菌药物表现为耐药,且多药耐药情况严重,耐药谱广,耐药基因携带率高,应从基因水平对耐药大肠杆菌进行传播机制的监测。     

华东葡萄遗传连锁图谱构建及灰霉病抗性QTL定位

【目的】构建华东葡萄遗传连锁图谱,并定位其抗灰霉病QTL,为华东葡萄种质资源的高效利用及其抗灰霉病基因发掘提供理论基础。【方法】以高感灰霉病的欧洲葡萄赤霞珠为母本、抗灰霉病的华东葡萄1058-2为父本,以二者杂交F₁代128株单株为群体材料,利用GBS(Genotyping-by-sequencing)简化基因组测序技术开发SNP分子标记,应用JoinMap 4.0构建遗传连锁图谱,使用MapQTL 6.0对F₁代抗灰霉病表型进行抗灰霉病QTL定位。与葡萄参考基因组PN40024进行比对分析,筛选QTL区间的抗病候选基因。【结果】2019和2020年杂交F₁代群体的灰霉病抗性多为中抗及以上。在亲本之间共鉴定到6357个SNP分子标记。挑选出在染色体上均匀分布的654个SNP分子标记用于构建华东葡萄遗传连锁图谱。该图谱包含19个连锁群,总长度为1843.67 cM,SNP分子标记间平均遗传距离为2.82 c M。根据2019和2020年的F₁群体灰霉病表型数据,连续两年在LG9连锁群上定位到1个与灰霉病抗性连锁的QTL,命名为Rbc1。该QTL与SNP分子标记np6008紧密连锁,在2019和2020年表型中可解释的变异率分别为13.1%和12.6%。参考葡萄基因组PN40024的物理图谱和基因注释信息,Rbc1位于9号染色体物理距离5969~12345 kb内,在这个QTL区间含有45个与抗病性相关的基因,编码含有LRR结构域的受体激酶和推测的抗病蛋白。【结论】葡萄灰霉病抗性是多基因控制的数量性状,抗性亲本华东葡萄1058-2中存在抗病的主效QTL。筛选出的45个与抗病性相关的基因可能参与调控葡萄灰霉病抗性,后续可作为候选基因进一步解析华东葡萄1058-2灰霉病抗性功能。     

副溶血弧菌对罗氏沼虾肝胰腺和鳃组织中呼吸相关酶活性及抗氧化酶基因表达的影响

【目的】探讨副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）肝胰腺和鳃组织中呼吸相关酶活性和抗氧化酶基因的影响,以期为罗氏沼虾免疫机理研究和病害防治提供参考依据。【方法】选取规格整齐、健康的罗氏沼虾,分别注射PBS溶液（对照组）和副溶血弧菌（试验组）,在第1、3、6、12、24、48、72和96h统计累计存活率,并取肝胰腺和鳃组织进行呼吸相关酶活性及抗氧化酶相关基因表达测定。【结果】罗氏沼虾感染副溶血弧菌后,随着时间的推移,其累计存活率逐渐下降,在96h累计存活率为72%。感染副溶血弧菌后,其肝胰腺中的ATP合酶、细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶活性随时间延长均呈先降低后上升最后趋于对照组水平的变化趋势,且在6~24h 3种酶活性均显著低于对照组（P<00.05,下同）,之后酶活性逐步上升;活性氧（ROS）含量则呈先上升后下降的变化趋势,且在6~48h显著高于对照组;超氧化物歧化酶（SOD）基因、过氧化氢酶（CAT）基因及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势。在鳃组织中,ATP合酶、细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶的活性随着感染时间的延长呈先降低后上升至趋于对照组水平,在6~72h 3种酶活性不同时间段表现出显著下降趋势;ROS含量则呈先上升后下降的变化趋势;SOD、CAT和GPX基因相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势,且均在感染6h显著上调至最大值,其中GPX基因相对表达量在12~48h显著下调低于对照组,并在72h逐渐上调。【结论】副溶血弧菌感染罗氏沼虾后对肝胰腺和鳃组织中的呼吸相关酶及抗氧化酶基因产生显著影响,ROS水平呈上升趋势。虽然罗氏沼虾能通过自我调节呼吸相关酶和抗氧化酶基因促使机体抵御病原体入侵,但超过机体自我调节的限度时会对机体造成损伤。