凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

凡纳滨对虾Crustin-like基因的克隆及在副溶血弧菌感染条件下的表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33bp)和24bp的3′非翻译区(478～501bp),编码区为444bp,共编码147个氨基酸;对CL蛋白结构及功能的分析表明,该蛋白编码蛋白质含有1个信号肽、1个跨膜螺旋和1个WAP结构域;攻毒试验表明,副溶血弧菌刺激可导致CL基因表达量的明显变化,总体呈现出先降低后升高的变化趋势。【结论】克隆了凡纳滨对虾CL基因的全长,发现其与副溶血弧菌侵入后引发的免疫反应密切相关,可以作为副溶血弧菌感染前期诊断的参考指标。     

溶藻弧菌对凡纳滨对虾血细胞毒性及细胞凋亡和免疫相关基因的影响

[目的]明确溶藻弧菌对凡纳滨对虾的毒性影响及应激情况下对虾的生理响应,为揭示凡纳滨对虾的免疫机理提供参考依据.[方法]采用微量注射器于凡纳滨对虾第二、三步足间注射10.0μL溶藻弧菌悬液(1×108 CFU/mL),对照组注射等量灭菌生理盐水,分别于感染后0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 h取样,利用流式细胞仪测定对虾血细胞中的活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)含量,并以实时荧光定量PCR分析溶藻弧菌感染对血细胞过氧化氢酶基因(CAT)、QM基因、谷氨酰胺转移酶基因(TGase)、细胞色素C基因(CYC)和Caspase-3基因表达的影响.[结果]凡纳滨对虾感染溶藻弧菌后,其血细胞中ROS和NO含量均随感染时间的延长呈持续上升趋势;CAT基因的相对表达量在感染后6.0 h极显著升高至峰值(P<0.01,下同),随后持续下降,至感染后48.0 h极显著低于对照组;QM基因的相对表达量呈先降低后升高再降低的变化趋势,于感染后12.0 h达峰值,而后持续下降,至感染后48.0 h其相对表达量极显著低于对照组;TGase基因的相对表达量分别在感染后1.5和12.0 h出现峰值,从出现第2个峰值后开始快速下降,至感染后48.0 h其相对表达量显著低于对照组(P<0.05,下同);CYC基因相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,于感染后1.5 h达峰值,随后持续下降,从感染后12.0 h起低于对照组,但差异不显著(P>0.05);Caspase-3基因相对表达量在感染后1.5 h达峰值,至感染后6.0 h其相对表达量显著低于对照组,随后逐渐恢复,于感染后24.0 h出现第2个峰值,但至感染后48.0 h又降至正常水平以下.[结论]溶藻弧菌感染初期凡纳滨对虾启动免疫机制并产生ROS和NO以对抗病原菌入侵,随感染时间的延长,机体内积累过多ROS和NO,此时抗氧化系统被激活;当过多的ROS和NO无法被抗氧化系统清除时,CYC和Caspase-3等凋亡相关基因大量表达以清除受损细胞.     

凡纳滨对虾HSP10基因序列与低温表达分析

[目的]克隆分析凡纳滨对虾HSP10基因,为研究其在寒冷耐受过程中发挥调控功能提供参考依据.[方法]搜索EST库获得凡纳滨对虾HSP10基因序列,再通过RACE-PCR扩增获得凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR分析HSP10基因的组织表达及低温胁迫下表达量的变化.[结果]凡纳滨对虾HSP1基因cDNA全长720 bp,包含306 bp的开放阅读框,编码102个氨基酸.以各物种的HSP10蛋白序列构建系统进化树,能较好反映各物种间的进化关系.荧光定量PCR分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在各组织中呈遍在表达,其中以肌肉中的表达量最高.低温表达谱分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在低温处理凡纳滨对虾的各组织中均呈下调表达,当处理温度降至13℃,其在肝胰腺中表达量降至最低.[结论]凡纳滨对虾HSP10在结构和进化上较保守,其mRNA表达量在低温胁迫下呈下降趋势,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控作用.     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

抗菌肽对凡纳滨对虾抗病性和免疫指标的影响

以体质量为(0.163±0.07) g的凡纳滨对虾为研究对象,在饲料中分别添加0.2%,0.5%和1.0%微生物抗菌肽S200,养殖12周以后,分别进行白斑综合症病毒、哈维氏弧菌和副溶血弧菌攻毒,研究饲料中添加微生物抗菌肽S200对凡纳滨对虾攻毒实验结果和免疫指标的影响。结果表明,饲料中添加0. 2%和0. 5%微生物抗菌肽S200可以显著提高凡纳滨对虾攻毒后的存活率和溶菌酶、超氧化物岐化酶活性,当添加量为0. 2%时,凡纳滨对虾感染副溶血弧菌的累计死亡率最低,为10.0%。当添加量为0.5%时,凡纳滨对虾感染哈维氏弧菌和白斑综合症病毒的累计死亡率最低,分别为13.0%和20.0%,感染副溶血弧菌的累计死亡率为40. 0%,溶菌酶和超氧化物岐化酶活性分别为44.35和60.8 U·mg~(-1)prot,比对照组显著提高(P 0. 05)。当添加量为1. 0%时,凡纳滨对虾感染白斑综合症病毒、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的累计死亡率分别为53. 33%,20. 0%和40. 0%,溶菌酶和超氧化物岐化酶活性分别为9.8和50.17 U·mg~(-1)prot,与添加量为0. 5%相比,除了感染副溶血弧菌的累计死亡率相同(都是40. 0%)外,其他各项数据都低,说明过高剂量的微生物抗菌肽S200对凡纳滨对虾对病毒的抵抗力有一定的负面影响,与对照组相比,溶菌酶活性无显著性差异(P 0. 05),感染副溶血弧菌和白斑综合症病毒的累计死亡率较对照组显著提高(P 0. 05)。结果表明,在饲料中添加适量的微生物抗菌肽S200可以提高凡纳滨对虾感染细菌和白斑综合症病毒后的成活率和超氧化物岐化酶、溶菌酶的活性,提高凡纳滨对虾的免疫力,有助于凡纳滨对虾养殖成功。     

凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达

[目的]明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA(LvcrustinA)在毕赤酵母菌中的表达情况,为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础.[方法]采用全基因合成法(PAS)合成LvcrustinA基因,然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα,所得重组质粒转化感受态细菌TOP10,以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转至毕赤酵母菌GS115;以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况,并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用.[结果]以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115,获得的重组菌株在30℃下摇床(220 r/min)培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA,且随培养时间的延长,其表达量逐渐增多.Western blotting鉴定结果显示,纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别.保护试验结果表明,融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力.[结论]利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA,且获得的LvcrustinA具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用.     

亚硝基氮胁迫下WSSV对凡纳滨对虾致病性研究

为评价养殖水环境中亚硝基氮(NO_2~--N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)危害性,开展NO_2~--N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响研究。试验设置NO_2~--N胁迫浓度为6.68 mg·L~(-1),分别注射10~(-4)和10~(-5)稀释度的WSSV提取液,结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达90.00%,显著高于无胁迫组(60.00%),相同试验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NO_2~--N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV增殖加快,感染48 h后10-4攻毒浓度胁迫组病毒量是无胁迫组1.33倍,72 h时病毒量达到无胁迫组2.00倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,NO_2~--N浓度突变导致对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先升后降。由此可见,NO_2~--N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内增殖,导致高死亡率,这可能是胁迫造成对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降所致。     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表达分析

[目的]研究丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)在凡纳滨对虾天然免疫应答过程中的作用。[方法]利用PCR技术克隆凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP),并进行生物信息学分析,进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行组织表达分析以及白斑杆状病毒(WSSV)刺激后的表达变化分析。[结果]成功从凡纳滨对虾体内克隆了Lv-SP基因的开放阅读框ORF,碱基数为1 104 bp,共编码367个氨基酸,在线分析软件预测其蛋白分子量为41 k D,等电点PI为6.93;在线分析软件预测显示:Lv-SP基因预测的氨基酸序列保守性很高,含有1个clip结构域和1个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc);系统进化发生分析表明:Lv-SP氨基酸序列与中国明对虾以及中华绒螯蟹的丝氨酸蛋白酶(SP)同源性较高,而与按蚊、小蜂窝甲虫的SP同源性较低;qRT-PCR分析结果显示:Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中均有表达,并且在鳃和血中表达量较高,而在心和肝中表达量较低,病毒WSSV刺激后,Lv-SP基因在48.0 h和72.0 h有显著的上调表达趋势。[结论]Lv-SP基因保守性比较高,并且其在一定程度上参与了对虾应答病毒侵染的免疫反应,推测它有可能作为重要的免疫调控基因在对虾的防御应答过程中发挥作用。     

利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达

[目的]研究传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHH-NV）感染凡纳滨对虾的基因差异表达,为进一步了解IHHNV与凡纳滨对虾的相互作用分子机制提供参考.[方法]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,测序获得的序列除去接头后用iAssembler软件进行拼接得到unigene（单一基因序列）,通过计算各unigene的转录本数目（RPKM）确定差异表达基因,并以实时荧光定量PCR验证基因的差异表达.[结果]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,共获得208690条短序列,序列拼接共得到21912条tmigenes;通过对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾的测序数据比较分析,结果发现221个差异表达基因,包括81个上调表达基因和140个下调表达基因.经实时荧光定量PCR验证,454高通量测序数据统计的基因表达差异结果可靠.[结论]IHHNV感染显著影响凡纳滨对虾免疫相关基因的表达,而利用高通量测序技术可有效检测出这些差异表达基因.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

小菜蛾阿维菌素和虫酰肼抗性品系对几种新型药剂的交互抗性研究

以敏感品系为对照,利用室内筛选获得的虫酰肼和阿维菌素高抗品系Teb-R和Aba-R,测定了小菜蛾对几种新型杀虫剂的交互抗性。结果发现:小菜蛾对虫酰肼产生高水平抗性后(抗性倍数185.5倍),对阿维菌素表现出中等水平交互抗性(41.0倍),对茚虫威(11.4倍)和溴虫腈(5.3倍)仅表现出低水平交互抗性,对多杀菌素(1.7倍)和氯虫苯甲酰胺(1.4倍)则没有表现出明显的交互抗性。用阿维菌素筛选Teb-R品系39代后获得阿维菌素高抗品系Aba-R(593.8倍),该品系对茚虫威(12.3倍)表现出中等水平交互抗性,对多杀菌素(7.9倍)表现出低水平交互抗性,对溴虫腈(2.7倍)和氯虫苯甲酰胺(0.9倍)的交互抗性不明显;同时该品系对虫酰肼的抗性也由阿维菌素筛选前的185.5倍下降到筛选后的28.0倍,也没有交互抗性。基于上述研究结果认为,使用虫酰肼防治小菜蛾出现抗性后,可以使用多杀菌素和氯虫苯甲酰胺进行替代防治,但不宜用阿维菌素、茚虫威和溴虫腈进行替代防治;利用阿维菌素防治小菜蛾产生抗性后,可以用溴虫腈、氯虫苯甲酰胺和虫酰肼进行替代防治,但不宜用多杀菌素和茚虫威。     

Water quality,agriculture and food safety in China:Current situation,trends, interdependencies,and management

Water quality in China is becoming a severe challenge for agriculture and food safety,and it might also impact health of population via agriculture and food. Thus,it is causing widespread concern. Based on extensive literatures review and data mining,current situation of water pollution in China and its effects on food safety were analyzed. The 2nd National Water Resource Survey in China show that the surface water all over the country was under slight pollution and about 60% of groundwater is polluted. Drinking water quality is basically guaranteed in urban area but it is worrisome in rural areas. In addition,China is the largest consumer of fertilizer and pestici de in the world and the amounts of application still show increasing trends. Fertilizers and pesticides are the most important sources of pollution,which affect human health as persistent organic pollutants and environmental endocrine disruptors. Eutrophication of surface water and nitrate pollution of groundwater are serious threats to drinking water safety. Sewage irrigation is becoming a pollution source to China's water and land because of lacking of effective regulations. Although,with the advance in technology and management level,control of nitrogen and phosphorus emissions and reducing water pollution is still a major challenge for China.     

断根与打顶对番茄嫁接愈合的抑制作用

【目的】断根嫁接苗和打顶双干或多干嫁接苗日益广泛用于番茄栽培,丰产作用显著。了解断根与打顶对番茄嫁接愈合的作用机制,可为番茄嫁接生产提供理论依据。【方法】以‘硬粉8号’为接穗品种,‘砧爱1号’为砧木品种,观测断根和打顶后番茄嫁接愈合进程、成活率和木质部连通性等,同时测定嫁接接合部生长素和细胞分裂素的含量及愈合相关基因的表达。【结果】断根和打顶抑制了嫁接接合部上方木质部分化基因VND7的表达,并显著延迟了木质部的重构。断根显著降低了嫁接后12和72 h接合部玉米素核苷（tZR）和反式玉米素（tZ）的含量,以及嫁接后12 h接合部吲哚-3-乙酸（IAA）,吲哚-3-乙酸甲酯（ME-IAA）和吲哚-3-甲醛（ICAld）的含量;打顶嫁接后12 h接合部IAA和ME-IAA含量显著低于对照和断根处理,下调了嫁接后3和12 h接合部上方和下方韧皮部分化相关基因NEN4表达水平。断根或打顶均下调了嫁接后3—48 h接合部上方细胞分裂相关基因Histone H4和SlcycB1-4的表达水平;断根和打顶同时处理使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量显著低于断根处理,使tZR和tZ的含量及木质部连通性显著低于打顶处理。打顶和断根后分别在嫁接接合部施用10 mmol∙L^-1 IAA和10 mmol∙L^-1 6-BA可显著促进嫁接苗木质部的重构。【结论】断根和打顶分别降低接合部细胞分裂素和生长素积累,下调愈合相关基因表达,降低木质部输导能力,进而延缓番茄嫁接愈合进程。     

鱼池水中钾钠的火焰原子发射光谱分析

本文研究了用火焰原子发射光谱法分析鱼池水中钾钠的方法。对方法精密度、回收率和共存元素的干扰进行了考察。建立了最佳测试条件。表明本方法简易、快速、准确。它亦适用对天然水中钾钠的测定。     

锌、锰、铜对大蒜吸收硒的影响

本试验通过盆栽大蒜探讨土壤施硒、锌、锰、铜对大蒜吸收这些元素以及这些元素之间的相互影响。结果表明,随着土壤施硒量的增加,土壤中硒的有效含量增加,大蒜地上部和地下部含硒量也增加;土壤施锌、锰、铜对大蒜吸收硒几乎没有影响;而硒会明显地抑制大蒜对锌元素的吸收,对锰、铜的吸收虽有抑制但只在地下部明显,因此,土壤施硒的量一定要合适。     

离子铵和非离子氨对海蜇螅状幼体和碟状幼体的毒性研究

在温度（２０±１）℃，盐度２２￣２４‰条件下，对海蜇螅状幼体和碟状幼体进行了ｐＨ适应性试验和不同ｐＨ下氨氮的急性毒性试验，结果表明：适合海蜇螅状幼体和碟状幼体生活的ｐＨ范围为７￣９，最适ｐＨ范围为７．５￣８．５，在此ｐＨ范围内，不仅非离子氨具有毒性，离子铵在浓度高时亦具有毒性。对于螅状幼体，此毒性倍数约为１１７￣２２０。