TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

[目的]建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术.[方法]根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性.[结果]TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101~1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%~1.75%,组间变异系数为0.81%~1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高.[结论]利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测.     

凡纳滨对虾HSP10基因序列与低温表达分析

[目的]克隆分析凡纳滨对虾HSP10基因,为研究其在寒冷耐受过程中发挥调控功能提供参考依据.[方法]搜索EST库获得凡纳滨对虾HSP10基因序列,再通过RACE-PCR扩增获得凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR分析HSP10基因的组织表达及低温胁迫下表达量的变化.[结果]凡纳滨对虾HSP1基因cDNA全长720 bp,包含306 bp的开放阅读框,编码102个氨基酸.以各物种的HSP10蛋白序列构建系统进化树,能较好反映各物种间的进化关系.荧光定量PCR分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在各组织中呈遍在表达,其中以肌肉中的表达量最高.低温表达谱分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在低温处理凡纳滨对虾的各组织中均呈下调表达,当处理温度降至13℃,其在肝胰腺中表达量降至最低.[结论]凡纳滨对虾HSP10在结构和进化上较保守,其mRNA表达量在低温胁迫下呈下降趋势,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控作用.     

凡纳滨对虾eIF5A基因的克隆及表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是真核生物细胞内的蛋白质翻译起始因子.近年来的研究发现eIF5A在动植物细胞衰老死亡、环境胁迫应答和免疫应答等过程中起着重要的调控作用.通过对凡纳滨对虾cDNA文库进行测序,首次获得了包含eIF5A完整的氨基酸序列的cDNA.该cDNA包含474 bp的开放阅读框,编码157个氨基酸,预测分子量约为17.257 ku,理论等电点为5.06.凡纳滨对虾eIF5A和其他物种对比结果显示,该基因的氨基酸序列和其他物种有较高的同源性.实时定量RT-PCR结果显示,eIF5A基因在凡纳滨对虾不同组织中的mRNA表达没有明显的差异.对WSSV、TSV和IHHNV感染的凡纳滨对虾的肝胰腺的实时定量RT-PCR结果显示,病毒感染的凡纳滨对虾的eIF5A基因的表达明显增加,分别是对照样品表达量的2.2、2.5和1.6倍,表明eIF5A可能涉及凡纳滨对虾的抗病毒免疫应答.     

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

凡纳滨对虾微卫星分子标记的开发及不同养殖家系遗传多态性分析

[目的]基于第三代高通量测序技术——单分子实时(SMRT)测序开发凡纳滨对虾微卫星分子标记,为凡纳滨对虾的遗传育种研究提供基础资料.[方法]采用SMRT测序对凡纳滨对虾转录组进行测序,经Illumina测序纠错后利用MISA对获得的转录组数据进行分析;以Primer 3.0设计微卫星引物,随机挑选40对微卫星引物进行PCR扩增验证,并选用扩增成功且具有多态性的微卫星引物用于不同养殖家系凡纳滨对虾遗传多态性分析.[结果]凡纳滨对虾转录组SMRT测序共获得51367条非冗余全长转录本序列,鉴定出39674条微卫星序列;微卫星的分布密度为0.232 SSR/kb;以二核苷酸重复微卫星序列分布最多,共有22223条(占56.01%).随机选取的40对微卫星引物中有26对微卫星引物能成功扩增出特异性条带;微卫星荧光分型结果显示,有16个微卫星位点具有多态性,共获得67个等位基因,平均等位基因数(Na)为4.2个,计算获得的平均观测杂合度(Ho)为0.511,平均期望杂合度(He)为0.451,平均多态性信息含量(PIC)为0.489.在16个微卫星位点中,有2个微卫星位点为低度多态性(PIC<0.25),6个微卫星位点为中度多态性(0.250.50);有4个微卫星位点偏移Hardy-Weinberg平衡(P<0.05),其余12个微卫星位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05).[结论]采用SMRT测序开发凡纳滨对虾微卫星分子标记是一种简单而高效的途径,有助于开展凡纳滨对虾的遗传育种研究工作.     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾

【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。     

凡纳滨对虾HSP1噬因序列与低温表达分析

【目的】克隆分析凡纳滨对虾HSPIO~因,为研究其在寒冷耐受过程中发挥调控功能提供参考依据。【方法】搜索EST库获得凡纳滨对虾HSPIO~因序列,再通过RACE—PCR扩增获得凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR分析HSPIO基因的组织表达及低温胁迫下表达量的变化。【结果】凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长720bp,包含306bp的开放阅读框,编码102个氨基酸。以各物种的HSP10蛋白序列构建系统进化树,能较好反映各物种间的进化关系。荧光定量PCR分析结果显示,凡纳滨对虾HSPIOmRNA在各组织中呈遍在表达,其中以肌肉中的表达量最高。低温表达谱分析结果显示,凡纳滨对虾HSPIOmRNA在低温处理凡纳滨对虾的各组织中均呈下调表达,当处理温度降至13℃,其在肝胰腺中表达量降至最低。【结论】凡纳滨对虾HSP10在结构和进化上较保守,其mRNA表达量在低温胁迫下呈下降趋势,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控作用。     

广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析

【目的】了解凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）在广西的分布、流行特点及趋势,为研究制定广西对虾IHHN的综合防控措施提供参考。【方法】根据广西凡纳滨对虾养殖情况,分别在北海市、钦州市、防城港市设立监测区,每个监测区设3-5个监测点,2010-2012年每年5月和9月进行两次采样,应用PCR对采集样品进行IHHNV检测,阳性产物送至宝生物工程（大连）有限公司测序,并与NCBI数据库中的IHHNV序列进行比对。【结果】2010年共检测凡纳滨对虾298份,IHHNV阳性率62.1%;2011年共检测凡纳滨对虾300份,IHHNV阳性率44.3%;2012年共检测凡纳滨对虾299份,IHHNV阳性率32.1%;3年的检测结果均以北海市的IHHNV感染率最高。2010、2011和2012年虾苗和中成虾的IHHNV阳性率分别为49.6%和72.1%、35.5%和49.2%、27.3%和36.9%。2010、2011和2012年5月和9月的IHHNV阳性率分别为53.2%和71.8%、35.2%和50.6%、21.6%和37.0 %。【结论】2010-2012年IHHNV在广西凡纳滨对虾主要养殖地区均有不同程度的流行,且中成虾IHHNV阳性率高于虾苗,每年9月的IHHNV阳性率高于5月,但广西近年通过严格控制亲虾品质及引进无病毒感染种苗,凡纳滨对虾品质已得到提升,IHHNV感染呈逐年下降的趋势。     

桃拉综合症病毒感染诱导的凡纳滨对虾microRNA表达差异的研究

microRNAs(miRNAs)在调节动物的获得性和先天性免疫中发挥重要作用。为研究病毒感染对凡纳滨对虾miRNA表达的影响,构建了桃拉综合症病毒感染和对照的凡纳滨对虾的小RNA文库,利用Solexa高通量测序技术对小RNA文库进行测序,分别得到61854276和65320117条小RNA序列,其中有2864337条序列被注释为保守的miRNA,对应87种已知的miRNA。对高表达量的miRNA进行表达差异分析,得到了22个差异表达miRNA,其中8个上调表达,14个下调表达。对差异表达miRNA的靶基因进行了预测,其中预测得分最高的靶基因大多数涉及到动物的免疫或细胞凋亡功能,说明miRNA在对虾的免疫机制中起着非常重要的作用。研究结果提供了凡纳滨对虾miRNA响应病毒感染的表达谱的基础资料,这将有助于揭示miRNA在对虾的抗病毒免疫机制中的作用。     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8．50×10^6 CFU,重组率在95％左右,插入片断大小为0．5～4．0kb,多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多（27．03％）,与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

凡纳滨对虾转录组测序分析及肌肉生长发育相关基因的筛选

【目的】筛选出凡纳滨对虾生长发育的功能基因及代谢调控网络,揭示其生长发育的分子机制,为后续开展凡纳滨对虾分子生物学研究提供宝贵的基因数据来源。【方法】以快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织为研究材料,通过Illumina HiSeqTM2500平台对构建的cDNA文库进行高通量测序分析,以StringTie进行拼接组装后利用DESeq2筛选差异表达基因,并基于KOG、GO、nr、COG、Swiss-Pro、KEGG和Pfam等数据库进行差异表达基因功能注释分析。【结果】经拼接组装共获得53458844条Clean reads,各样品Clean reads的Q30均在93.00%以上;Illumina测序获得的Clean reads与参考基因组的比对效率在87.75%~87.80%,说明转录组测序数据真实可靠。采用SnpEff进行SNP/InDel变异注释分析,结果显示,SNP位点中以A>G、G>A、C>T和T>C等4种类型的数量较多（14950~21562个）,InDel位点则以SYNONYMOUS_CODING的数量最多（33630个）。使用StringTie对Mapped reads（比对到参考基因组的Reads）进行拼接,共发掘到4607个新基因,分别输入COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和nr数据库中进行序列比对,最终发现共有1098个新基因被注释,以被nr数据库注释的新基因数量最多（1077个）,而被COG数据库注释的新基因数量最少（416个）。基于Q-value<0.05且Fold Change>2的筛选条件,共获得1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）;1408个差异表达基因被注释到53个GO功能条目中,其中,22条被注释到生物学过程（Biological process）,16条被注释到细胞组分（Cellular component）,15条被注释到分子功能（Molecular function）;KEGG信号通路富集分析发现3条重要的信号通路,分别是溶酶体通路（Lysosome）、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）及鞘脂类代谢（Sphingolipid metabolism）。在溶酶体通路中,CTSL基因、Nramp基因、MyoG基因和Myf5基因在凡纳滨对虾快速生长群体肌肉组织中呈上调表达,而Trypsin基因呈下调表达。【结论】通过转录组测序分析从快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织中筛选出1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）,主要富集在溶酶体、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢及鞘脂类代谢等通路上,在对虾肌肉生长发育过程中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表达分析

[目的]研究丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)在凡纳滨对虾天然免疫应答过程中的作用。[方法]利用PCR技术克隆凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP),并进行生物信息学分析,进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行组织表达分析以及白斑杆状病毒(WSSV)刺激后的表达变化分析。[结果]成功从凡纳滨对虾体内克隆了Lv-SP基因的开放阅读框ORF,碱基数为1 104 bp,共编码367个氨基酸,在线分析软件预测其蛋白分子量为41 k D,等电点PI为6.93;在线分析软件预测显示:Lv-SP基因预测的氨基酸序列保守性很高,含有1个clip结构域和1个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc);系统进化发生分析表明:Lv-SP氨基酸序列与中国明对虾以及中华绒螯蟹的丝氨酸蛋白酶(SP)同源性较高,而与按蚊、小蜂窝甲虫的SP同源性较低;qRT-PCR分析结果显示:Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中均有表达,并且在鳃和血中表达量较高,而在心和肝中表达量较低,病毒WSSV刺激后,Lv-SP基因在48.0 h和72.0 h有显著的上调表达趋势。[结论]Lv-SP基因保守性比较高,并且其在一定程度上参与了对虾应答病毒侵染的免疫反应,推测它有可能作为重要的免疫调控基因在对虾的防御应答过程中发挥作用。     

凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ型基因4种不同剪切体的序列分析

采用RT-PCR技术克隆了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因全长编码序列,对其核苷酸序列和编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,并在对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的编码区查找了单核苷酸多态性位点。结果显示：本研究克隆获得了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的4个可变剪切体,其编码的蛋白质均具有Troponin超家族结构域特征,同源性比对发现该蛋白的氨基酸序列在节肢动物中高度保守。系统进化分析发现凡纳滨对虾Tn-Ⅰ3和Tn-Ⅰ4与中国对虾和小龙虾的Tn-Ⅰ遗传距离较近,而Tn-Ⅰ1和Tn-Ⅰ2单独聚为一支,且与其他物种Tn-Ⅰ遗传距离较远;通过测序比较不同个体凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因序列发现在Tn-Ⅰ的4种不同剪切体编码区共同序列区第302位和472位碱基分别存在2个（A/G） SNP位点,其中位于第302位碱基的（A/G）错义突变使编码氨基酸由甘氨酸变为了谷氨酸（G/E）。凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因不同剪切体及编码区错义突变的发现为进一步探讨其基因功能奠定了基础。     

蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响

[目的]研究蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响,为今后将蜈蚣藻多糖开发成凡纳滨对虾免疫增强剂提供理论依据.[方法]将试验凡纳滨对虾随机分为4组,其中A组（对照组）对虾投喂基础饵料,B、C、D组对虾分别喂食含有0.1％、0.2％和0.3％蜈蚣藻多糖的药饵,饲养15d后采用实时定量PCR对各组凡纳滨对虾的肝胰腺组织真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、血蓝蛋白、酚氧化酶原、C凝集素、溶菌酶、热休克蛋白70等7个免疫相关基因的表达水平进行检测.[结果]投喂基础饵料和投喂蜈蚣藻多糖药饵的凡纳滨对虾在外表和行为上无明显差别,且均未出现对虾死亡现象.与A组相比,B、C、D组对虾肝胰腺组织中血蓝蛋白、酚氧化酶原、热休克蛋白70等3个基因的表达量明显升高,且均表现为D组＞C组＞B组＞A组;而真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、C凝集素、溶菌酶等4个基因的表达量无明显变化.[结论]蜈蚣藻多糖可影响凡纳滨对虾的非特异性免疫功能,今后可将蜈蚣藻多糖用于对虾病害防治,以减少化学药物的使用.     

低温处理与常温凡纳滨对虾基因差异表达文库的构建及分析

[目的]筛选出对虾耐寒相关基因,为今后进一步研究对虾耐寒分子机理提供科学依据.[方法]利用SSH技术构建低温处理与常温凡纳滨对虾的基因差异表达文库,并通过斑点杂交、克隆测序分析及候选基因RT-PCR扩增等对差减获得的耐寒相关功能基因进行验证.[结果]在构建的正、负文库768个克隆中有152个为低温高表达克隆、331个为常温高表达克隆;将正文库100个克隆拼接可获得ESTs同源群39个,其中已知基因29个,主要涉及能量代谢、表达调控、信号传导、细胞免疫、抗细胞凋零、蛋白质加工及其他基因等;将负文库50个克隆拼接可获得ESTs同源群18个,其中已知基因17个,主要涉及细胞免疫、维持细胞代谢、物质转运、信号传导及其他基因等.经RT-PCR验证,从正文库中筛选出的HSPB1、NGT4和NGT7基因在低温条件下的表达量显著高于常温.[结论]综合运用SSH、斑点杂交、克隆测序和RT-PCR可有效筛选并验证凡纳滨对虾耐寒相关基因,为揭示对虾耐寒分子调控机制奠定基础.     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。