omd基因对斑马鱼骨骼矿化的影响

omd基因编码骨调蛋白,可以调控人类骨骼中钙的沉积。目前关于omd基因对鱼类骨骼钙化的作用尚不清楚,为了探究omd基因对鱼类骨骼的影响,本文调查了omd基因在斑马鱼的不同发育阶段和不同组织的表达,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建斑马鱼omd基因敲除型(omd_-/-^{)。结果发现}omd基因在斑马鱼体内随着发育表达量逐渐增加,在脊柱和肌肉中表达较高；相比野生型斑马鱼,omd_-/-^{品系斑马鱼的肌肉细胞未发现明显变化,脊柱的平均钙含量下调}59.81%；与野生型相比,omd_-/-^{品系斑马鱼平均游动距离下降}33.93%,平均游动速度下降39.44%,相对静止的时间增加88.26%,游动能力下降。这些结果表明 omd基因对斑马鱼脊柱的矿化起到重要作用,并在一定程度上影响了斑马鱼的活动能力。     

aguA基因缺失对嗜水气单胞菌致病性的影响

嗜水气单胞菌是水环境常见的病原体,具有较强致病性。在本研究中,首次敲除了嗜水气单胞菌aguA基因,通过转录组分析发现aguA敲除后细菌的粘附、致病、胺代谢等生物过程下降。通过qRT-PCR进一步验证发现10个粘附基因、9个发病基因和8个胺代谢基因的mRNA表达水平明显下降；此外,转录组水平分析结合qRT-PCR验证发现VI型分泌系统基因、II型分泌系统基因、鞭毛合成相关基因、菌毛合成相关基因、溶血基因、I型分泌系统基因、肠毒素基因、RTX基因等毒力基因的RNA表达水平也出现下调。对两株菌进行草金鱼的体内感染实验,与野生菌株相比,aguA敲除株感染草金鱼的致病力降低了7.47倍,且aguA敲除株生物膜形成能力降低了16.6%。以上结果显示aguA基因与嗜水气单胞菌的致病性密切相关。     

溶藻弧菌RseB基因缺失对凡纳滨对虾致病性的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种条件性嗜盐革兰氏阴性致病菌,是水产养殖常见的病原菌。本实验利用OverlapPCR和同源重组技术,构建RseB基因敲除突变株,以研究RseB在溶藻弧菌致病性方面的作用。结果表明,与野生型溶藻弧菌(ATCC17749)相比,RseB基因的缺失提高了溶藻弧菌的生长速度,溶血性下降了约1.6倍。凡纳滨对虾侵染致病性试验结果显示,实验组凡纳滨对虾开始死亡时间推迟约为4h,LT50时间推迟20h小时,RseB基因缺失株对凡纳滨对虾肠道的侵染定殖能力下降2.2倍。这些结果表明,RseB基因对于溶藻弧菌正常的生理功能、溶血性及毒力都有重要作用。S     

鳗弧菌vah1缺失菌株构建及致病性评估

为了构建减毒鳗弧菌菌株,本文通过基因重组和Overlap PCR技术,敲除鳗弧菌中的毒力基因vah1,构建vah1缺失鳗弧菌菌株△vah1,缺失菌株△vah1的生长速率没有变化,溶血活性下降了9.5倍,生物膜形成能力下降。通过感染凡纳滨对虾,得出野生菌株的半数致死量为(3.16±0.8)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株△vah1的半数致死量为(9.77±0.5)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株的半数致死量提高了约3.09倍,在对虾体内的定植能力下降了约3倍左右,对凡纳滨对虾的肝胰腺细胞造成的溶解和空泡化的破坏程度下降了,引起凡纳滨对虾的免疫基因CAT、SOD、PO、LZM、ACP的表达水平低于野生菌株。△vah1鳗弧菌菌株为后续减毒疫苗菌株或抗鳗弧菌特异性免疫增强剂制备奠定基础。     

MsxC基因在斑马鱼肌间刺和大侧肌发育中的作用

肌间刺存在于有些真骨鱼类的肌间隔中。已有研究表明，作为Hox基因家族成员，MsxC（muscle segment homeobox C）基因的表达模式与唇鱼骨肌间刺形成有一定的相关性。为了进一步探究MsxC基因在肌间刺形成中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立了斑马鱼MsxC基因纯合突变体（MsxC-/-）。结果表明，与野生型斑马鱼相比，MsxC-/-斑马鱼尾部的髓弓小骨和脉弓小骨平均缩短15%以上，差异极显著，而躯干部的肌间刺长度则无明显差异；MsxC-/-斑马鱼大侧肌肌隔周围白肌细胞分布疏松，且排列混乱，越靠近尾部差异越明显；MsxC-/-突变体红肌面积增大，越靠近尾部，红肌面积增大越明显，尾部红肌面积增大2.22%（p<0.01），而躯干靠前部位面积增大0.97%（p<0.05）。以上结果表明，MsxC基因的缺失既影响了肌间刺的形成，同时也影响了大侧肌的发育。