慈姑蛋白酶抑制剂（API）基因导入棉花获得转基因植

通过花粉管通道技术将慈姑蛋白酶抑制剂API（Arrowhead Proteinase Inhibitor）基因转入棉花，获得了转基因植株。经对棉铃虫抗虫性鉴定和PCR、RT－PCR、Southern blotting分析，证明了获得了表达API 基因的抗虫棉。     

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。     

猪囊尾蚴API基因原核表达条件的优化

【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂(API)基因在大肠杆菌中的最佳表达条件,为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料,对影响API蛋白表达的载体(pEGX-4T-1、pET-30a)、温度(25,30,37℃)、诱导时间(2,4,6,8h)、IPTG终浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和卡那霉素终浓度(100,200,300,400mmol/L)等条件进行优化,筛选重组蛋白最佳的表达条件。对在最佳条件下获取的目的蛋白进行超声处理,4℃、10 000r/min离心分别收集上清液和沉淀,对目的蛋白进行可溶性分析;SDS-PAGE后,将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上,与抗His标签抗体共孵育,检测目的蛋白的反应原性。【结果】当选择pET系列载体(pET-30a)时,API表达量高于其在pGEX系列(pGEX-4T-1)中的表达量。API融合蛋白最佳表达条件为:在含200mmol/L卡那霉素的LB培养基上于37℃培养3h后,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG,再于30℃诱导培养6h。SDS-PAGE结果表明,pET-30a/API融合蛋白分子质量约为53ku,与预期蛋白分子质量一致。Western-blot检测结果显示,重组蛋白pET-30a/API能够识别特异性抗体,显示获得了大量表达正确的目的蛋白。【结论】确定了API基因的最佳表达条件,获得了较大表达量的API融合蛋白。     

传统肉制品中一株植物乳杆菌的分离筛选及鉴定

从传统发酵酸肉中分离出一株乳酸杆菌(XC10001),利用API鉴定系统、16S rDNA同源性分析以及recA基因多重PCR特异性扩增3个方法对该菌株进行鉴定,API鉴定结果和16S rDNA同源性分析结果都表明该菌株同植物乳杆菌的同源性最高;多重PCR扩增后发现一条约300 bp的recA基因特异扩增片段,对该片段测序后发现同植物乳杆菌ATCC14917序列完全相同,因此将该菌确定为植物乳杆菌.菌株XC10001的16S rDNA序列的国际基因序列注册号为HM446157.     

青杨双价抗虫基因转化系统研究

利用农杆菌介导法，对青杨进行含部分改造的Bt CryAc基因(Bt基因)和慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因A的双价抗虫基因转化，确定了适于青杨的遗传转化系统。经含Km40mg/L的生根培养基的筛选，获得了青杨转基因植株。     

山羊痘病毒疫苗株TK基因的克隆与序列分析

用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计TK基因的特异性引物并进行PCR扩增,获得了2405bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在唯一的ACC65I酶切位点和3′末端早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗株G14-STV44-55TK基因与基因Bank中发表的13个参考毒株的同源性在96%和95%以上,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

基于巢式PCR的重叠延伸PCR优化

[目的]结合巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[方法]以褐飞虱Actin 1基因启动子区与EGFP表达盒区基因融合为例,通过巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[结果]成功获得融合片段,经过巢式PCR优化后大大简化试验流程,缩短试验时间,并增强PCR特异性与检出率。[结论]优化了重叠延伸PCR,可更快速高效融合基因片段。     

早春短命植物节律基因CCA1的核心扩增及初步鉴定

文章以十字花科角毛茛科角果毛茛幼苗为材料,提取其总RNA,反转录,通过RT-PCR扩增节律钟CCA1基因的核心片段并对其进行菌液PCR的初步鉴定。实验结果表明,提取的RNA条带清晰、整齐,经PCR扩增获得了约500bp的片段,经菌液PCR初步鉴定为CCA1基因的核心片段。该核心片段的获得,为进一步克隆节律钟CCA1基因全长及对该基因的结构及表达特性的研究奠定一定的基础。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1.以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto.采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化.PCR检测NPT II基因的结果表明已获得转基因番茄植株.     

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。     

棉花化学调控技术

分析了棉花化学调控效果 ,并提出棉花系统化学调控技术体系的指导思想、应用原则、作用特点、体系内容及应用的注意事项     

结球甘蓝抗虫转基因植株及其后代的抗性表现

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶 (NPTⅡ )基因的重组质粒导入结球甘蓝栽培品种春甘蓝“鸡心 2 3”和秋甘蓝“黑叶头”。对转基因当代植株 (T0 )及其自交后代 (T1、T2 、T3)群体进行卡那霉素抗性、抗虫性鉴定和分子检测。经PCR DNA分子杂交检测 ,确认抗虫基因———豇豆胰蛋白酶抑制剂基因已整合到受体植株的基因组中 ,并在有性生殖过程中传递给后代。卡那霉素抗性和抗虫性状在T0 代植株上得到表达 ;T1代植株中发生分离 ;T2 代中呈现出 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系 ;从T3 代中获得卡那霉素抗性和抗虫性纯合的株系。试验结果显示 ,卡那霉素抗性和抗虫性状在转基因植株自交后代中的表现基本符合显性单基因的分离规律。在T2 、T3 代抗虫性纯合的株系中 ,鳞翅目小菜蛾、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的 1～ 2龄幼虫校正死亡率为 6 %～ 10 0 % ,从中选出一批校正死亡率达 80 %左右的单株     

除草剂对棉田杂草群落结构的影响

１９９６－１９９９年连续４年用棉田常用三类除草剂盖草能，乙草胺，草甘膦按常规方法防除棉田杂草，观察一除草剂连续使用后棉田杂种群结构的变化，结果表明，连续使用单一除草剂对棉要草种群结构影响显著，盖草能作用后，禾本科杂草的发生量逐年下降，至第四年已不再发生，而阔叶草的发生量在禾本科杂草被防除的当年即迅速上升，且大大超过对照（不用药）杂草发生总量，乙草胺处理能显著控制杂草的发生量，但残存杂草尤其是阔叶杂草逐年增多，到第三，第四年，田间生物量也接近对照，草甘膦连使用后，虽当年除草效果良好，但次年田间杂草发生基数并未得到控制，禾本科草，阔叶草逐年略有上升，且结构有所变化，阔叶杂草上升量略快于禾本科杂草。     

杂种棉“苏杂16”的杂种优势及F2自交衰退

以陆地棉品种间杂交种“苏杂16”为材料，连续两年测定其F1，F2的14个性状的杂种优势的自交衰退率，结果表明：（1）苏杂16F1皮棉产量及其构成因素（衣分除外）的中亲优势与竞争优势极显著水平，其中铃重优势大于结铃数优势，铃重构成因素中单铃种子数和结籽效率的杂种优势极显著，纤维品质性状中，比强谨亲优势显著，竞争优势极显著。（2）苏杂16F2皮棉产量及构成因素（衣分除外）的杂种优势虽存在衰退现象，但中亲优势与竞争优势仍达显著或极显著水平，其中铃数优势大于铃重优势，铃重构成因素中以子指的优势为主。（3）苏杂16F1，F2的衣分均具微小中亲优势，而竞争优势显著低于对照组“泗棉3号”，纤维整剂度均本及对照接近，麦克隆值的竞争优势无意显著，F1，F2的株高杂种优势分别达极显著和显著水平，（4）F1杂种优势大的性状，其F2自交衰退率一般也较大，（5）只要亲本选配得当，F2是可以利用的。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

过表达棉花葡萄糖醛酸激酶基因GbGlcAK促进拟南芥细胞伸长

纤维品质改良一直是棉花育种的重要目标。基于纤维不同发育时期的RNA-seq数据，发现1个在海岛棉和陆地棉间差异表达的葡萄糖醛酸激酶基因（glucuronic acid kinase/glucuronokinase，GlcAK）。从海岛棉（Gossypium barbadense）Pima90-53纤维中克隆了GbGlcAK，其ORF为1 101 bp，编码366个氨基酸。GbGlcAK具有GHMP 激酶 N和C结构域，为GHMP超家族成员，属于可溶性非分泌蛋白，与拟南芥GlcAK亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示GbGlcAK分布在细胞质中。超表达GbGlcAK的拟南芥叶表皮毛、下胚轴、下胚轴细胞和根的长度较野生型均极显著增加，UDP-D-GlcA代谢相关基因表达量增加，果胶含量显著增加，说明过表达GbGlcAK能够上调UDP-D-GlcA代谢通路相关基因的表达从而提高果胶含量，进而促进细胞伸长，这为进一步研究GbGlcAK在棉纤维发育中的功能提供了参考。     

双价抗虫转基因棉花研究

构建了携带人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC。采用花粉管通道法,将pGBI121S4ABC转入到石远321、中棉所19号、3517和541中国棉花生产品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系。叶片室内抗虫生物学鉴定表明,抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%;经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达。     

Selection of Homozygous Cotton Lines Transformed with Two Insect-Resistant Genes

A plant expression vector containing a chimeric Bt29K gene coding for the activated Cry1Ac protein and the arrowhead proteinase inhibitior gene API-B were introduced into the cotton cultivar Jihe321 mediated by Agrobactertium tumefaciens. Based on the results of kanamycin resistant testing, PCR detection for both foreign genes and insect bioassay using Heliethis armigera, nine transgenic homozygous cotton lines with insect-resistance of more than 90% and better agronomic traits were bred through six generations from the original transgenic plants. Results from insect bioassay and sequence analysis of the PCR products of plants from some homozygous lines indicated that the chimeric Bt29K gene was stably inherited in these transgenic cotton lines. The main agronomic characters of these homozygous cotton lines, such as boll productivity and fibre strength, were better than that of the original cotton cv. Jihe321.     

Bt抗虫棉棉田棉铃虫防治指标研究

经 1996～ 1999年 4年试验观察 ,Bt抗虫棉棉田棉铃虫卵至三龄幼虫存活率 ,二代为 1.3% ,三代为 5.5%。田间幼虫与被害蕾铃比分别比普通棉田提高 35.1%和 2 1.3%。结合对普通棉田复合防治指标研究 ,初步确定Bt抗虫棉棉田棉铃虫防治指标为 :二代百株幼虫 5.2头或百株卵量 4 0 0粒 ,三代百株幼虫 4 .7头或百株卵量 85粒