苏云金杆菌新菌株WB9 cry1基因型的PCR-RFLP分析

利用 PCR- RFLP技术对 Bt新菌株 WB9的 cry1基因型进行分析 ,结果表明该菌株含有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和 cry1Ga 5种 cry1基因型 ,且 cry1Ab的酶切产物不同于正常的 cry1Ab.采用特异引物对 G1/ G2扩增 ,也证明 WB9含有 cry1Ab基因 .在此基础上 ,再利用引物对 G1/ K3un2进行扩增 ,其产物经回收纯化后用 Eco R / Xba 双酶切分析 ,结果也表明 WB9所含的 cry1Ab与众不同 ,无大片段出现且有一条 4 0 0 - 5 0 0 bp的特异片段     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立

根据苏云金芽孢杆菌（Bt）cry2、cry3、cry4/cry10型基因的保守区分别设计了3对通用引物S5un2/S3un2、S5un3/S3un3和S5un4/S3un4。PCR扩增产生约1.2kb、1.4kb和1.5kb的产物,然后分别用HincⅡ/MspⅠ、Bg1Ⅱ/PstⅠ和BstEⅡ/DraⅠ酶切,并经RFLP分析鉴定Bt菌株的cry基因型。利用该方法对含已知cry2、cry3、和cry4/cry10型基因的Bt菌株和遗传工程菌进行基因分析,得到的结果与预测的RFLP相符,证明该方法可行。在此基础上对14株Bt分离株的基因型进行了鉴定,其中有9株分离株含cry2型基因;仅菌株Bt22含cry3型基因;所有被测菌株均不含cry4/cry10型基因。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

 Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。     

1株对多种害虫高活性的苏云金杆菌Bt CYZ-4

通过生物测定得到了对多种重要农林害虫高活性的苏云金杆菌菌株Bt CYZ-4,对其基因型鉴定表明:该菌株基因型较丰富.该菌株对粘虫(Mythimna separata)初孵幼虫48h LC50为6.6×106个/mL(芽孢密度);对美国白蛾(Hyphantria cunea)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫72h LC50分别为2.9×106、2.25×105和4.7×106个/mL;对林业害虫杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)二龄幼虫72h LC50为1.7×106个/mL,同时该菌株对卫生害虫淡色库蚊(Culex pipiens paliens)也表现出较好的活性,24h LC50为2.01×105个/mL.利用cry1、cry2、cry3、cry7、cry8、cry9和vip3A基因引物对该菌株进行基因型鉴定,并对其扩增片段进行限制性酶切分析,结果表明,该菌株含有cry1Ac、cry1Ab、cry2Ab和vip3A基因,不存在cry3、cry7、cry8、cry9基因,其它基因型仍有待鉴定.SDS-PAGE分析表明,晶体蛋白质的分子质量主要为130、70、57、27ku,营养期为88ku.该菌株是一株具有应用潜力的Bt野生株.     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。     

苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株基因型的鉴定

利用聚合酶链式反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术鉴定苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株的杀虫晶体蛋白及其基因组成.PCR结果表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因型.采用5对通用引物-Un1、Un2、Un3、Un4、Un7/8进行PCR扩增,结果显示:Un1和Un2引物扩增的DNA片段大小分别为270 bp和700 bp左右,其他引物无PCR扩增产物.SDS-PAGE结果也表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因,它们编码的杀虫晶体蛋白分子量约为130 kD和65 kD.     

对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定

利用PCR-RFLP对Bt.新菌株cyz-13,T4-3的基因型进行分析。结果表明,cyz-13含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Bc,cry2Ab4种基因型,其中cyz-13菌株的PCR产物的酶切片断类型不同于已知的基因类型;T4-3菌株含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ag,cry2Ac,cry1Ia5种基因型。室内生测结果显示,两菌株对甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、玉米螟均具有高毒力,好于H D-1标准菌株。两菌株的发酵液均有杀虫活性,二者上清的杀虫因子不同。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）cry2Ac4基因；笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板，利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因，进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接；成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109，从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4，再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，经IPTG诱导后，对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测；cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

苏云金杆菌cry Ⅰ A(a)、cry Ⅰ A(b)和cry Ⅰ A(c)基因型的PCR分析鉴定

根据苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）杀虫晶体蛋白基因的结构特点,合成了ｃｒｙⅠ基因５′端特异引物和３′端共同引物,利用ＰＣＲ扩增,使不同基因引物产生不同长度的扩增产物,通过扩增产物片段的分子量大小来确定菌株所含杀虫基因类型．本研究对福建农业大学生物技术中心分离和保存的２０个菌株进行了ｃｒｙⅠＡ（ａ～ｃ）基因类型的ＰＣＲ鉴定．结果表明：４个菌株含有ｃｒｙⅠＡ（ａ）、ｃｒｙⅠＡ（ｂ）和ｃｒｙⅠＡ（ｃ）基因,２个菌株含有ｃｒｙⅠＡ（ａ）和ｃｒｙⅠＡ（ｃ）基因,其余菌株不含所鉴定的基因类型．     

源自动物粪便苏云金芽胞杆菌的cry基因型鉴定

从5种草食性哺乳动物的粪便中筛选获得8株苏云金芽胞杆菌(Bt);并用聚合酶链式反应—限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定体系鉴定各菌株的cry基因型.结果表明:BRC-WCB1、BRC-WCB2、BRC-WCB3、BRC-WCB8同时含有cry1和cry2基因;BRC-WCB6仅含有cry1I基因;BRC-WCB5含有cry3基因,但未出现预知的酶切条带;而BRC-WCB4无任何PCR扩增产物.     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

小孢子链格孢的IGS-RFLP分析

用基因间隔区特异性引物对10个小孢子链格孢种和作为对照的1个大孢子链格孢种(茄链格孢)(Al-ternaria solani)进行扩增,小孢子链格孢种获得约3.0kb片段,而大孢子链格孢种获得约4.0kb片段,大孢子种和小孢子种可通过IGS扩增片段明确区分.分别用限制性核酸内切酶HaeⅢ和MspⅠ对小孢子链格孢的扩增产物进行限制性酶切,可产生不同的酶切图谱.根据酶切图谱可以把细链格孢和细极链格孢区分.IGS扩增产物表现出长度和序列结构上的多态性,是一个良好的遗传标记,对于一个种内的不同菌株具有一定鉴别意义,但是由于利用现有引物一些菌株难以扩增出PCR产物,该方法的利用受到一定限制.     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Ty-1和cf-5基因

利用同一PCR反应体系同时扩增、筛选分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-1基因和番茄抗叶霉病的cf-5基因紧密连锁的SCAR标记,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合.与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqⅠ酶切位点,酶切后分别产生了303 bp和95 bp以及398、303 bp和95 bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点,酶切后仍呈现398 bp的特异带.与cf-5基因紧密连锁的SCAR2标记扩增后抗感材料均产生960 bp的特异片段,用限制性内切酶TaqⅠ酶切后,含cf-5基因的材料产生一条256 bp的特异带,而不含cf-5基因的材料产生一条225 bp的特异带.     

利用PCR技术同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi-1)和抗叶霉病基因(Cf-9)

   利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗根结线虫的Mi-1基因和抗番茄叶霉病的Cf-9基因紧密连锁的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合与Cf-9基因紧密连锁的CAPSl标记在抗病试材中可扩增出2775 bp的特异片段,且存在Taq I酶切位点,酶切后产生1177 bp、446 bp、370 bp和160 bp的不同特异片段;与Mi-1基因紧密连锁的CAPS2为共显性标记,抗性材料中产生915 bp的特异片段,Taq I酶切后产生719bp和196 bp的特异片段该体系可用于在同一PCR反应体系中对Mi-1和Cf-9 2个抗病基因进行同时筛选鉴定该体系的建立不仅省时、省工,节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程     

黑龙江省南瓜疫病菌遗传多样性分析

试验利用通用引物ITS1和ITS4对南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)的19个菌株的ITS rDNA进行扩增,然后利用4种限制性内切酶酶切PCR扩增产物,分析各菌株间的DNA限制性片段多态性。运用ITS通用引物在所有供试南瓜疫病菌菌株上均可扩增到一条长为575bp的特异DNA片段。经限制性内切酶酶切和聚类分析,将黑龙江省南瓜疫病菌可划分为4种病原型。运用一对ITS通用引物扩增供试菌株得到20个ITS标记,其中多态性标记占95%。供试菌株在遗传上有相似性,差异也非常明显,表明南瓜疫病菌群体内部存在着丰富的遗传多样性。     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

苏云金杆菌cryⅠA（a）,cryⅠA（b）和cryⅠA（c）基因型的PCR？…

根据苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）杀虫晶体蛋白基因的结构特点,合成了ｃｒｙⅠ基因５‘端特异引物和３’端共同引物,利用ＰＣＲ扩增,使不同基因引物产生不同长度的扩增产物。通过扩增产物片段的分子量大小来确定菌株所含杀虫基因类型。本研究对福建农业大学生物技术中心分离和保存的２０个菌株进行了ｃｒｙⅠＡ（ａ－ｃ）基因类型的ＰＣＲ鉴定。