基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白合成肽抗体的制备及应用

【目的】制备基因I型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP7蛋白合成肽抗体并验证其特异性,为研究VP7外衣壳蛋白在基因I型GCRV病毒与宿主间的相互作用及研制基因工程疫苗提供参考依据。【方法】以GCRV GZ1208株为模板进行RT-PCR扩增,运用在线生物信息学分析软件对VP7蛋白B细胞表位进行功能预测,选择位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列进行人工合成,与钥孔血蓝蛋白载体蛋白偶联后免疫新西兰白兔以获得VP7蛋白合成肽抗体,然后采用Western blotting和间接免疫荧光试验验证VP7蛋白合成肽抗体对基因I型GCRV的特异性识别能力。【结果】VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守,其合成肽抗体效价约1∶256000。Western blotting分析结果显示,融合蛋白VP7约在55 kD处出现单一的特异性条带,而GZ1208株和JX0901株样品约在30 kD处出现对应的特异性条带,与预期结果基本一致;间接免疫荧光试验结果表明,VP7蛋白合成肽抗体可特异性识别感染基因I型GCRV的草鱼脑细胞(GCB),感染细胞中出现特异性绿色荧光信号,而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB细胞中均无特异性绿色荧光出现。【结论】制备获得的VP7蛋白合成肽抗体能特异性识别基因I型GCRV,而不识别其他基因型毒株,可用于草鱼出血病的临床诊断和基因I型GCRV的病原学研究。     

草鱼病毒性出血病流行性病学及防控措施

草鱼生长速度快、养殖产量高、经济效益好,其养殖规模居中国所有养殖鱼类首位。草鱼病毒性出血病由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)感染引起,是危害草鱼养殖最严重的疾病。该病发病期长,传染性强,防治困难,无特效药,一旦发病,其死亡率可达80%以上。本文从典型症状、组织病理学特征、基因型、病因等角度对草鱼病毒性出血病的流行情况进行剖析,并就该病的生态预防、免疫预防提供参考建议,对推动草鱼健康养殖具有积极的意义。     

草鱼呼肠孤病毒研究进展

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要品种,为四大家鱼之一,尤其在我国气候温暖的南方如长江、珠江水域养殖量极大.然而草鱼在幼苗阶段极易发病,其中威胁最大是草鱼出血病(grasscarp hemorrhage),死亡率可高达90％以上.草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是草鱼出血病的主要病原,由于其高度传染性与致死性,对我国草鱼养殖业造成了极大的损失.近年来,关于草鱼呼肠孤病毒的研究逐步增多,并且出现了新基因型报道,引起了多方关注.对草鱼呼肠孤病毒的病原学、分子生物学、免疫原性、检测和综合防治等进行综述,并展望未来的研究方向,旨在对该病的防治和深入研究提供指导.     

特异性识别草鱼呼肠孤病毒感染细胞的ssDNA核酸适配体筛选与鉴定

[目的]筛选出能高特异性和高亲和性识别草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染细胞的核酸适配体,为研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV检测技术打下基础,同时为提高水产疫病检测及防控效率提供技术支持.[方法]以草鱼呼肠孤病毒I型(GCRVI)感染的宿主细胞为靶标,采用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)进行特异性核酸适配体筛选,并通过激光共聚焦显微技术和流式细胞术对筛选获得的核酸适配体性质进行系统分析.[结果]筛选获得的核酸适配体GVIK1能特异性识别并结合在GCRVI感染的草鱼肾脏组织细胞系(CIK)表面,但不识别正常的CIK细胞及石斑鱼神经坏死病毒广西株(GNNV)感染的石斑鱼脾细胞(GS);其二级结构具有独特复杂的茎环结构,吉布斯自由能(△G)为-32.93 kJ/mol,无细胞毒性.核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的亲和常数(Kd)为148.22 nmol/L,即核酸适配体GVIK1与靶标细胞间的亲和力极强,达纳摩尔级别.核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点是细胞膜蛋白或膜蛋白相关结构,其在靶标细胞表面的结合位点出现在病毒感染后的第5h.临床试验结果表明,筛选获得的核酸适配体GVIK1可作为高特异性分子探针用于诊断GCRV感染所致的草鱼出血病.[结论]基于SELEX技术筛选获得能特异性识别GCRVI感染宿主细胞的核酸适配体GVIK1,可作为核酸分子探针用于研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术,实现实时监测和有效防控.     

Polymorphism amongst several CPA4 gene sequences and correlation analysis of growth traits in grass carp

[目的]筛选出更多与草鱼生长相关的SNP位点标记,为草鱼分子育种研究提供理论依据.[方法]根据草鱼EST数据库中属于消化酶的羧肽酶A4基因的cDNA序列设计引物,采用PCR产物直接测序法,对含预计SNP位点的cDNA序列进行扩增、测序,并寻找新的SNP位点.[结果]cDNA上预计的SNP位点不存在,但在内含子3上检测到两个SNP位点,分别位于内含子的第40、241个碱基处,命名为A40G位点和G241T位点.经创造酶切位点的限制性片段长度多态检测(CRS-RFLP),发现A40G位点AA型占50.3％、AG型占23.8％、GG型占25.9％,G241T位点的GG型占48.6％、GT型占47.9％、TT型占3.5％.利用一般线性模型(GLM)将两个SNP位点与草鱼6个生长性状进行关联分析,结果表明,A40G位点的GG型个体在体重、体长、体高均高于AA型和AG型,但差异不显著(P＞0.05);G241T位点TT型个体最重,GG型最轻,但差异不显著( P＞0.05);A40G和G241T两个位点组成的7种双倍型个体的体重、体长、体高、尾柄高等重要生长性状差异也不显著(P＞0.05).[结论]在草鱼羧肽酶A4基因的内含子3上发现两个SNP位点(A40G位点和G241T位点),每个SNP位点都可分为3种基因型,但两个SNP位点的不同基因型以及由其组成的双倍型与草鱼的重要生长指标均不存在显著相关.     

黄芪多糖防治草鱼出血病的研究

[目的]防治草鱼出血病,提高草鱼成活率。[方法]用黄芪多糖、维生素K3粉、板蓝根和维生素C等免疫增强剂拌通威饲料在4个水域进行投喂,开展草鱼出血病的初步治疗试验。[结果]水域1草鱼在用药后的第4天基本没有鱼发病死亡,之后没有发生草鱼出血病。水域2草鱼6月24日用药,6月26日病愈,并且没有出现草鱼出血病复发现象。水域3草鱼在用药后第3天完全病愈,之后没有复发。水域4草鱼在用药后第4天死鱼现象停止,之后没有复发。[结论]在草鱼饲料中添加适量的黄芪多糖、维生素K3粉、维生素C,可提高草鱼对病毒的抵抗能力,达到治疗草鱼出血病的效果,添加适量的板蓝根对草鱼有保肝利胆作用。     

草鱼羧肽酶A4基因部分序列多态性及生长性状关联分析

[目的]筛选出更多与草鱼生长相关的SNP位点标记,为草鱼分子育种研究提供理论依据.[方法]根据草鱼EST数据库中属于消化酶的羧肽酶A4基因的cDNA序列设计引物,采用PCR产物直接测序法,对含预计SNP位点的cDNA序列进行扩增、测序,并寻找新的SNP位点.[结果]cDNA上预计的SNP位点不存在,但在内含子3上检测到两个SNP位点,分别位于内含子的第40、241个碱基处,命名为A40G位点和G241T位点.经创造酶切位点的限制性片段长度多态检测(CRS-RFLP),发现A40G位点AA型占50.3%、AG型占23.8%、GG型占25.9%,G241T位点的GG型占48.6%、GT型占47.9%、TT型占3.5%.利用一般线性模型(GLM)将两个SNP位点与草鱼6个生长性状进行关联分析,结果表明,A40G位点的GG型个体在体重、体长、体高均高于AA型和AG型,但差异不显著(P>0.05);G241T位点TT型个体最重,GG型最轻,但差异不显著( P>0.05);A40G和G241T两个位点组成的7种双倍型个体的体重、体长、体高、尾柄高等重要生长性状差异也不显著(P>0.05).[结论]在草鱼羧肽酶A4基因的内含子3上发现两个SNP位点(A40G位点和G241T位点),每个SNP位点都可分为3种基因型,但两个SNP位点的不同基因型以及由其组成的双倍型与草鱼的重要生长指标均不存在显著相关.     

应用dsRNA测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染

从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病疑似病料提取物感染的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒基因组dsRNA,电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。应用简化的FLAC(full-length amplification of cDNA)技术扩增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序列BLAST分析表明:其中3个基因组片段与GCRV-873第5、9、10片段高度同源,另外1个基因组片段与GCRV-HZ08第11片段高度同源;因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸,但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的病毒总RNA进行RT-PCR检测并测序,结果显示这3个片段与GCRV-HZ08第5、9、10片段均具有99%同源性,表明是由于混合感染而存在两株不同病毒的核酸dsRNA,两株病毒分别命名为GCRV-JX01和GCRV-JX02。首次运用dsRNA测序法检测出了GCRV病毒的混合感染,为草鱼呼肠孤病毒的流行病学和防控提供了一种新的技术选择。     

草鱼载脂蛋白A-I-1基因3＇非编码区SNPs筛选及其与生长性状的关联分析

采用PCR产物直接测序法和PCR-RFLP法对草鱼EST文库中载脂蛋白A-I-1基因（Apoprotein A-I-1,apoA-I-1）3＇非编码区进行SNPs筛选,在珠江水系草鱼Ctenopharyngodon idella养殖群体144个样本中发现2个SNPs位点。C792T位点的CC型占46.53%,CT型占50.69%,TT型占2.78%;G851A位点的GG型占77.08%,GA型占20.83%,AA型占2.08%。采用一般线性模型对2个SNPs位点与草鱼4个生长性状———体质量、体长、体高和头长进行关联分析,结果表明：C792T位点TT型个体的体质量、体长、体高和头长均值高于CT型和CC型个体的生长性状指标值,但未达到显著水平（P〉0.05）;G851A位点GG型个体的体质量、体长、体高和头长均值高于GA型和AA型个体的生长性状指标值,且GG型个体的体长和头长均值与GA型和AA型个体均存在显著差异（P〈0.05）。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型,关联分析结果表明,双倍型D3（TTC792T-GGG851A）个体的体质量均值最高,D6型（CCC792T-AAG851A）个体的体质量均值最低,且二者在体长、体高、头长均值间存在显著差异（P〈0.05）。推测C792T位点TT型为有利基因型;G851A位点GG型为有利基因型,AA型为不利基因型。本研究结果为草鱼分子辅助育种提供了候选标记,为加快草鱼育种进程奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

为了解草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)的感染流行情况及早期临床诊断的需要,研究并建立了该病毒的RT-PCR检测方法。根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株GCHV-892总RNA为模板,RT-PCR反应扩增出712 bp的目的条带,并对PCR反应体系和反应程序进行了优化,测定了该方法的敏感性和特异性。敏感性试验结果表明以含VP6蛋白基因的重组质粒为模板,该PCR方法的最低检测限为102copies.μL-1,特异性试验表明该引物仅能扩增GCRV核酸,而与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应性。应用所建立的RT-PCR方法检测了7份疑似出血病草鱼病样,3份病料获得了阳性扩增,随机挑选其中的1份阳性样品经克隆后测序,结果显示与GenBank中已知序列最高有99%的相似性。     

关于唐代草、青、鲢、鳙养殖业兴起的原因

从池养鲤为主到四大家鱼的形成,是我国渔业史与我国渔业科技史上的重要突破。对于突破的原因,从本世纪60年代到现在一种相当流行的看法是:唐代禁捕、禁食鲤的法律,促使人们去寻找新的养殖种类,从而草、青、鲢、鳙养殖业逐渐兴起与形成。本文从历史文献记载,从大量史料分析与科学论证,否定了上述论断,认为这一重大突破是我国生产力长期发展的结果,是我国渔业科学技术长期发展的结果,是商品生产价值规律推动的结果,唐代一度颁布的禁捕、禁食鲤律并非这一重大突破的主要原因。     

利用RAPD标签分析3种鲤科鱼群体的遗传变异

[目的]利用RAPD技术对草鱼、鲢鱼和鲫鱼群体遗传变异进行初步研究。[方法]用20种10 bp长的随机引物对草鱼、鲢鱼和鲫鱼进行RAPD-PCR扩增,从20种引物扩增出来的DNA条带中筛选条带清晰的6种引物,分析这3种鱼的遗传变异。[结果]结果表明:草鱼与鲢鱼的RAPD指纹图谱带型差别不明显,草鱼与鲢鱼、鲫鱼品种间的带纹相似系数分别为0.375和0.416,遗传距离分别为0.625和0.584;鲢鱼与鲫鱼品种间带纹相似系数为0.366,遗传距离为0.634。[结论]RAPD是一种非常灵敏的种间鉴定技术,特别是对鱼种类的鉴定有重要意义。     

利用微卫星标记分析长鳍鲤、锦鲤和龙凤鲤的遗传多样性

利用20对微卫星标记埘长鳍鲤、锦鲤和龙凤鲤3个鲤鱼群体的遗传多样性和遗传结构进行分析.结果表明:3个群体在20个位点上分别检测到108、164、154个等位基因,各群体等位基因数2～16个不等,平均有效等位基因数分别为4.496、5.695和5.606.3个群体平均期望杂合度分别为0.769、0.806、0.801,多态信息含量分别为0.703、0.761和0.757,遗传多样性指数分别为0.764、0.803和0.799,群体间遗传分化系数为0.071.结果说明3个群体遗传多样性较为丰富.     

鲤、鲢、鳙、草鱼苗和鱼种饥饿致死时间的研究

作者观测了全长6.6～177.6 mm的鲤、鲢、鳙、草鱼苗和鱼种的饥饿致死时间及饥饿死亡时皮肤和肠的组织学及亚微结构变化。在水温18.0～23.0℃时,这几种鱼苗50％饥饿致死时间为7.3～12.0d,耐饥饿力由强至弱依次为:鲤(10.4～12.0d)>鳙(9.6 d)>草鱼(8.8 d)>鲢(7.3d)。夏花至春片鱼种的50％饥饿致死时间为15～271d。水温与鱼的饥饿致死时间呈负相关。饥饿致死的鲤苗皮肤破裂,指纹状细胞界限不清,排列散乱,粘液细胞小,神经丘萎缩;鲢、鳙鱼苗肠粘膜细胞核和细胞器或肿胀或萎缩或溃解。     

用天然饵料培育鲤、鲢、鳙、草鱼苗的研究

连续3年(1989～1991)在总面积48.4亩的12口土池塘中放养鲤、鲢、鳙、草鱼苗(12～20万/亩),采用施肥培养天然饵料、人工投饲(豆浆)和二者结合3种方法饲养。结果表明,浮游动物规格适宜、营养全面、可得性强,用其培育上述几种鱼苗既经济简便,又可使成活率和生长速度提高15％以上。     

春繁赣昌鲫与湘云鲫当年养成商品鱼的生长速度比较试验研究

在养殖管理相同的条件下,将赣昌鲫与湘云鲫夏花鱼种分别混养在草鱼+鳙鱼鱼种培育池中。试验结果显示:赣昌鲫与湘云鲫的平均存活率分别为88.75%、92.92%,赣昌鲫的群体生长速度较湘云鲫的群体生长速度快10.37%,个体增长速度快14.28%。     

Effect of Nitrobenzene on the Embryo Development of Bighead and Silver Carp

The effect of various concentrations of nitrobenzene on the mortality and abnormality rate of bighead and silver carp embryos were studied to provide reference for the evaluation of the effect of nitrobenzene to aquatic organisms and aquatic environment. The results showed that the development of bighead and silver carp embryos was delayed, the mortality and abnormality rates were raised when the embryos were treated with ≥0.010 mg·L^-1 nitrobenzene, and with ≥0.085 mg· L^-1 nitrobenzene, the mortality rates showed 100%     

网湖鲢,鳙生长特性及合理放养的研究

研究了网湖鲢，鳙的生长特性，并以此为依据计算网湖鲢，鳙鱼种放养量，确定其合理捕捞规格。得出网湖１４．８５－１６．５ｃｍ鲢鱼种放养量为６６．１６万尾或２．４５０４万ｋｇ，１３．２ｃｍ鳙鱼种放养量为１１６．０５万尾或２．７６３１万ｋｇ鲢，鳙合理捕规格为０．５ｋｇ。     

州河鲤、乌克兰鳞鲤成鱼肌肉营养成分的对比分析

通过对州河鲤和乌克兰鳞鲤成鱼肌肉的粗蛋白、水分、灰分、粗脂肪以及氨基酸和脂肪酸构成等进行对比分析,为科学评估其营养品质提供基础数据。结果表明:乌克兰鳞鲤成鱼肌肉中的蛋白质(19.20%)、水分(78.76%)和灰分(1.45%)均极显著地高于州河鲤(18.52%、76.83%、1.20%;P0.01),而州河鲤的脂肪含量(3.76%)又极显著地高于乌克兰鳞鲤(1.79%;P0.01);州河鲤成鱼肌肉脂肪酸的种类、脂肪酸总量和必需脂肪酸含量(11种、2.88%、0.60%)均高于乌克兰鳞鲤(10种、0.64%、0.10%),且州河鲤脂肪酸的营养价值略高于乌克兰鳞鲤;州河鲤和乌克兰鳞鲤都含有18种氨基酸,而乌克兰鳞鲤的必需氨基酸含量、风味氨基酸含量和氨基酸总量(8.3%、7.58%、20.29%)均高于州河鲤(7.53%、6.48%、17.82%),乌克兰鳞鲤蛋白质的氨基酸组成优于州河鲤。综合以上分析可以得出,乌克兰鳞鲤较州河鲤更具有营养学优势。     

根据渔获物评价鲢、鳙放养比例的方法及应用

根据商品渔获物规格差异，直观地调整鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys nobilis）在湖泊水库中的放养比例，容易忽视鲢、鳙本身生长速度的差异以及捕捞方式和强度对鱼类正常生长的影响。综合考虑这两方面的影响，给出了根据商品渔获行组成判断鲢、鳙放养比例合理与否的方法。并在大伙房水库进行了应用。结果表明：大焦房水库目前鲢放养效果不佳，主要原因是捕捞方式不合理造成的，同时应该增加鳙的放养比例。