3种检测番茄抗根结线虫Mi基因分子标记法的比较

[目的]Mi基因是目前番茄遗传育种及生产实践中应用最为广泛的根结线虫抗源,通过对3种分子标记法检测番茄中Mi基因的结果进行比较与分析,以期为番茄抗根结线虫遗传育种提供准确、高效的分子鉴定方法。[方法]采用酶切扩增多态性序列(CAPS)、引物对组合以及序列特征扩增区(SCAR)3种分子标记法分别检测16个番茄品种的Mi基因及其基因型,同时采用人工接种法测定番茄品种对南方根结线虫的抗、感性。[结果]针对上述品种,3种分子标记法的检测结果存在着明显的差异,CAPS法检测全部供试番茄均含Mi基因,除‘线虫绝39号’外均为Mi/Mi纯合基因型;而PM3Fb/PM3Rb、PMi F3/PMiR3引物对组合检测和SCAR标记Mi23F/Mi23R检测的结果均显示有9个品种含Mi基因,前者检测表明‘VFN’‘双抗265’和‘双抗228’为Mi/Mi纯合基因型,但后者检测则显示仅‘VFN’和‘线虫绝39号’为Mi/Mi纯合基因型。接种测定结果显示:‘VFN’和‘线虫绝3号’为南方根结线虫免疫品种,‘双抗228’‘仙客1号’‘Sparta’和‘线虫绝39号’为高抗品种,‘双抗265’和‘牟番1号’为抗病品种,其余均为感病品种。[结论]CAPS法容易产生假阳性,不适用于番茄Mi基因的检测,而PM3Fb/PM3Rb、PMi F3/PMiR3的引物对组合和SCAR标记Mi23F/Mi23R这2种方法能够相对准确地检测番茄Mi基因,其中SCAR标记经单次PCR反应即可直接鉴定Mi基因的有无及其基因型,应用更为便捷。     

玉米免DNA制备单株SSR和SCAR基因分型方法研究

探讨采用免DNA制备法分析玉米单株SSR与SCAR分子标记的基因型.分别刮取各单株少许叶肉细胞到1×PCR缓冲液中,置于PCR仪上95℃10 min,冷却,添加PCR其它组份,完成SSR与SCAR的PCR扩增与显色成像.免除模板DNA制备过程,对掖478与丹340两个亲本及57个(共58个)F2分离群体单株分别实现SSR标记-phi402893基因型快速鉴定,对掖478与丹340两个亲本及5个F2分离群体单株分别实现SCAR标记-MITE185基因型快速鉴定.     

小麦抗白粉病基因Pm4的STS标记

根据与小麦抗白粉病基因Pm4a共分离的RFLP探针BCD1231的序列设计引物,以含小麦抗白粉病基因Pm4b的小麦近等基因系VPM/7*百农3217、抗病亲本VPM和轮回亲本百农3217为材料进行PCR扩增,结果在抗病池与VPM中扩增出一条约为410bp大小的特异带STS410,而在百农3217中无此特异PCR扩增带.进一步对144株VPM/7*百农3217的F2分离群体进行遗传连锁分析,估算出该PCR标记STS410与抗病基因Pm4b的遗传距离为3.0cM.用设计的这对STS-PCR引物对8个感病品种和17个含Pm基因的抗病亲本进行PCR扩增,结果发现:STS410只出现在含有Pm4基因的材料中.因此,PCR标记STS410可方便地用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择育种.     

小麦抗白粉病基因Pm4的STS标记

根据与小麦抗白粉病基因Pm4a共分离的RFLP探针BCD1231的序列设计引物,以含小麦抗白粉病基因Pm4b的小麦近等基因系VPM／7百农3217、抗病亲本VPM和轮回亲本百农3217为材料进行PCR扩增,结果在抗病池与VPM中扩增出一条约为410bp大小的特异带STS410,而在百农3217中无此特异PCR扩增带。进一步对144株VPM／7^*百农3217的F2分离群体进行遗传连锁分析,估算出该PCR标记STS410与抗病基因Pm4b的遗传距离为3.0cM。用设计这对STS－PCR引物对8个感病品种和17个含Pm基因的抗病亲本进行PCR扩增,结果发现：STS410只出现在含有Pm4基因的材料中。因此,PCR标记STS410可方便地用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择育种。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

甘蓝抗枯萎病SCAR标记的开发

 【目的】开发与甘蓝枯萎病抗性基因紧密连锁的SCAR标记,利用该标记对甘蓝抗枯萎病基因跟踪、鉴定,为甘蓝抗枯萎病分子标记辅助选择奠定基础。【方法】以高抗枯萎病的甘蓝自交系8024与感病自交系6A为亲本构建F2代分离群体和相应F3代家系,通过F3代家系抗病性分离表现确认F2代单株的基因型,选择10株纯合基因型显性抗病单株和10株纯合基因型隐性感病单株,利用BSA法构建甘蓝抗感基因池,筛选出与甘蓝枯萎病抗性基因紧密连锁的AFLP标记,克隆测序后根据序列差异将其转化为SCAR标记,通过142株F2代分离群体连锁验证该标记与甘蓝枯萎病抗性基因的连锁关系,并利用两个不同的抗感分离F2群体共100株对SCAR标记的通用性进行验证。【结果】获得了1个以相斥相连锁的SCAR标记S46M48199,该标记在感病亲本中扩增出199 bp的单一条带,而在抗病亲本中无扩增条带,142株F2代分离群体连锁分析表明,其遗传距离为2.78 cM,在F66和C1两个F2群体中的通用性验证结果,与抗性鉴定结果的吻合率分别为81%和83%。【结论】开发的SCAR标记可用于甘蓝抗枯萎病的分子标记辅助育种。     

菜薹抽薹性状的ISSR和SRAP分析

以早抽薹品种CT07和晚抽薹品种T0601为亲本构建F2分离群体,采用分离集团混合分析法 (Bulked segregant analysis,BSA)筛选与菜薹抽薹基因连锁的分子标记.用45条ISSR(Inter-simple sequence repeat,简单重复序列间扩增)引物和20对SRAP(Sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)引物组合进行PCR扩增筛选,其中UBC834、UBC876、E13M4和E5M7对亲本和DNA池的扩增图谱表明,4个引物的差异条带均出现在早抽薹品种CT07和早现蕾(抽薹)池中.经F2代群体单株验证,4个标记均与早抽薹基因相连锁,且标记E13M4最近,距离为16.8 cM,这为菜薹抽薹基因的定位和分子标记辅助育种奠定了基础.     

白菜类作物开花时间相关基因CCA1的克隆及功能标记开发

以1年生的油用型品种Yellow sarson(YS-143)与2年生的芜菁品种Vegetable turnip(VT-044)的cDNA为模板,克隆出CCA1基因cDNA全长序列,分析其核苷酸多态性。在这2份材料构建的200株F_2分离群体中,选取极早和极晚开花的单株各24株,对在亲本上鉴定到的4个多态性位点进行PCR扩增,采用Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。构建pEZS-NL-CCA1载体,利用亚细胞定位技术,分析CCA1基因在真核细胞中的表达情况。序列分析表明,YS-143与VT-044分别有1 665、1 647个核苷酸,分别编码了554、548个氨基酸。亲本之间核苷酸序列分析鉴定到12个差异位点,氨基酸同源进化树分析表明,十字花科的不结球白菜、大白菜、萝卜、油菜、拟南芥、亚麻芥聚集在同一分支中,而禾本科的大麦、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F_2分离群体上,Pearson相关性鉴定到位于亲本第727至第732个碱基处的1个多态性位点(ACCCTT/ACCCTT),有该位点的群体单株平均开花时间为39 d,极显著早于缺失该位点的群体单株平均开花时间104 d(P0.01),表明白菜类作物CCA1基因的第727至第732个碱基的缺失(A05:472204-472209)与开花时间呈极显著相关,影响开花时间,可为光周期敏感的白菜类作物晚抽薹育种研究提供一定的理论依据。开发的该Insert/Delete(InDel)标记,可以作为功能分子标记进行辅助育种工作,以加快育种进程。亚细胞定位结果表明,CCA1基因主要在细胞核上表达。     

黄瓜性别控制基因CsACS1G的分子标记及其快速检测

根据黄瓜性别控制基因CsACS1G、CsACS1及BCAT基因DNA差异序列,设计CsACS1G基因特异标记引物G1/G2,采用碱处理法,快速提取黄瓜品种WI1983G、95、98-17、S-2-98及95×WI1983G的F1、F2群体植株DNA,并以此为模板进行PCR扩增.为了验证特异引物对检测CsACS1G基因的准确性,在黄瓜开花期间进行田间调查,结果表明,以快速提取的黄瓜DNA为PCR模板,特异引物G1/G2能稳定、准确扩增出CsACS1G基因特异片段,电泳检测结果与田间调查结果一致.     

水稻晚开花突变体lft1的鉴定与基因克隆

[目的]通过对水稻晚开花突变体lft1(late flowering time)的鉴定及基因定位,解析水稻响应光周期调控开花的分子机制。[方法]从‘日本晴’T-DNA插入突变体库中筛选得到一个在长日照下晚开花的突变体lft1。调查了lft1/日本晴F_2分离群体的开花期表型,分析晚开花表型与T-DNA插入之间的相关性。比较日本晴/9311 F_2群体和lft1/9311 F_2群体的开花期分布,选取群体中具有突变效应的极端晚开花单株进行基因定位。比较突变体lft1和野生型‘日本晴’中已知开花期基因的表达水平,分析基因在调控网络中的作用。[结果]相比于野生型‘日本晴’,突变体lft1在长日照条件下晚开花20 d,粒长和千粒质量均显著增加。对lft1/日本晴F_2群体调查发现,晚开花性状由1对隐性基因控制,且与T-DNA插入呈现非共分离。相比于对照日本晴/9311 F_2群体,在lft1/9311 F_2群体中出现了极端晚开花的个体,从中选取了58株极端个体用于基因的初定位。利用‘日本晴’和‘9311’之间的多态性分子标记对极端晚开花个体进行了图位克隆,将基因限定在第9染色体短臂上,分子标记RM219与RM3912之间,物理距离为2.94 Mb的范围内。在开发标记的过程中,发现分子标记SJ9-32能够在‘日本晴’和‘9311’中实现扩增,但是在lft1及其后代的极端个体中均不能有效扩增。通过进一步设计标记,我们最终验证了在lft1中存在DNA片段的缺失,该缺失区段覆盖了SDG724基因。等位性测验进一步证实lft1的晚开花表型是由于SDG724基因的缺失而引起的。q RT-PCR结果表明,SDG724可以调节Os MADS51和RFT1的表达水平。[结论]突变体lft1中由于SDG724基因的缺失,导致Os MADS51和RFT1的表达水平下调,从而引起晚开花性状。通过调控SDG724基因的表达水平来调节水稻开花期,这在生产上将具有重要意义。     

小麦抗叶锈基因Lr38的一个新标记

【目的】建立小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38特异的PCR标记。【方法】以Thatcher为对照,以TcLr38和TcLr38×Thatcher F2代单株构建的分离群体为材料,利用TcLr38远缘亲本中间偃麦草特异的SCAR标记引物进行PCR扩增获得单一条带,并以50个小麦抗叶锈近等基因系材料对该标记特异性进行检测,Mapmaker 3.0软件计算该标记与Lr38的遗传连锁距离。【结果】中间偃麦草特异的SCAR标记引物在TcLr38中获得单一扩增片段大小为982 bp,50个小麦抗叶锈近等基因系检测表明为TcLr38的特有条带,F2代分离群体验证表明为与Lr38共分离的分子标记,命名为Y38SCAR982。【结论】Y38SCAR982可以作为Lr38的分子标记,并证实该基因由中间偃麦草向普通小麦转移的事实。     

甘薯抗茎线虫病基因SCAR标记辅助育种初探

用已获得的与抗甘薯茎线虫病基因连锁的RAPD标记OPD01-700引物对高抗亲本徐781和高感亲本徐薯18的F1分离群体的161个品系进行PCR扩增.根据该标记扩增结果,利用Mapmaker3.0软件计算遗传距离,得出此标记与甘薯茎线虫病基因的连锁距离为19.4 cM.对RAPD标记OPD01-700片段进行克隆、测序,得到长度为689 bp的DNA序列,将该序列命名为OPD689.根据测序结果,设计1对特异引物,进行特异性扩增,成功地将OPD689标记转化为SCAR标记.将SCAR标记在7个高抗品系和13个高感品系进行初步验证应用,其结果与田间鉴定结果基本一致.初步建立了甘薯抗茎线虫病育种分子标记辅助选择技术.     

M342抗除草剂基因CAPS标记的开发与应用

M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。     

番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用

创建可以同时检测番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-2基因和抗晚疫病Ph-3基因分子标记的多重PCR体系,以快速准确地鉴定筛选到目标基因型。采用多重PCR结合CAPS技术,同时加入2对引物T0302和TG328,进行扩增及酶切反应,2%琼脂糖凝胶电泳检测,获得不同基因型相应的带型,从而建立多重PCR及产物酶切体系,优化此体系后再进行验证与应用。该多重PCR体系可靠高效,显示共有9种带型对应Ty-2和Ph-3基因相应的基因型,与采用单引物普通PCR技术分别鉴定的基因型结果一致,可以用于番茄分子标记辅助育种。     

琅琊鸡Mx基因3′端部分序列PCR-RFLP与序列分析（摘要）

[目的]从分子角度对琅琊鸡Mx基因的遗传变异进行研究,为琅琊鸡分子标记辅助选择、抗病育种提供依据。[方法]采用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。Mx基因3′端部分序列引物参考杨宁（上游引物P1：5′-GCCTACCAATACCTGG-TAGACTTT-3′,下游引物P2：5′-GCTCCCCCTCCTITCAAATA-3′）。琅琊鸡Mx基因3′端部分序列的PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电脉检测,在紫外凝胶成像系统下观察并保存图像。利用3%琼脂糖凝胶电泳检测HaeⅢPCR-RFLP。根据酶切结果,选取不同基因型个体的PCR扩增产物,用DNA快速纯化回收试剂盒纯化。根据《分子克隆试验指南》,经连接、转化、克隆后,按照TaKaRa公司质粒DNA小量纯化试剂盒说明,对经PCR扩增鉴定为阳性的菌液提取质粒。鉴定后将重组质粒送TaKaRa公司测序。[结果]琅琊鸡群体中存在Mx基因HaeⅢ酶切位点的多态性,且均有A、B两个等位基因,基因频率分别为0.562和0.438。经独立X~2性检验,Mx基因HaeⅢ酶切位点的基因型分布在琅琊鸡群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0.01）。对多态片段进行克隆测序分析,结果表明,该扩增片段长度大小为357 bp,通过DNAMAN分析软件对报道序列（NC_006088,杨宁）和Mx基因序列作比对分析,发现琅琊鸡Mx基因3′端部分序列扩增区域在20 506～20 862位点,变异序列在20771～20 802位点存在长度为31 bp的碱基缺失。HaeⅢ在本序列195 bp位点存在识别序列,对AB基因型（2条带）个体酶切产物是长度为195 bp和162 bp的2段,在3%琼脂糖凝胶中显示2条带;对AA基因型（1条带）个体发生酶切反应时,由于存在62～93位点长度为31 bp碱基缺失,所以酶切产物是长度为164 bp和162 bp的2段,与试验预期结果相一致。[结论]在山东省地方鸡种琅琊鸡Mx基因3′端序列中发现存在HaeⅢ-RFLP。     

超甜玉米bt2基因SNP位点的分析及分子标记辅助筛选

【目的】利用等位基因特异PCR技术对超甜玉米的基因型进行分子鉴定,建立根据单核苷酸多态性(SNP)进行分子标记辅助筛选的平台。【方法】根据超甜玉米基因bt2启动子区域序列设计引物,通过等位基因特异PCR扩增,对PCR产物进行测序,利用ClustalX软件,分析比较了32份超甜玉米自交系bt2基因启动子区域的核苷酸序列,并进行了分子鉴定。【结果】在扩增的888bp序列中有3个SNP位点,分别在bt2基因转录起始上游的-20,-103和-107bp处,通过对32份超甜玉米自交系的SNP位点分析,将其区分为AAA和GGG 2种单体型。【结论】利用3个SNP位点中的-103(A/G)位点进行等位基因特异PCR,成功地鉴定了超甜玉米自交系的基因型,建立了通过等位基因特异PCR辅助筛选bt2基因的平台。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的SRAP-SSR(eSSR)分析

小麦抗叶锈基因Lr38在我国高抗叶锈病,直到目前该基因的分子标记开发较少,开发其分子标记对于该基因的研究与利用具有重要意义。利用594对SRAP-SSR(eSSR)引物组合对以Thatcher为背景小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38和Thatcher进行PCR扩增。引物组合ARBI8-Xcwem8R和ARBI2-Xgwm497F在TcLr38中分别扩增出300和400bp多态性条带。利用47个小麦抗叶锈近等基因系进一步检测,引物ARBI8-Xcwem8R仅在TcLr38中扩增出特异条带。经TcLr38×Thatcher F2代分离群体验证,该标记与Lr38遗传距离较远。对该片段克隆测序,片段长度为277bp,BLAST比对与GenBank中所收录序列无相似性,该片段为与Lr38相关的新的序列。     

加工番茄Tm-22基因的SCAR鉴定

[目的]建立利用SCAR标记技术鉴定番茄花叶病毒病抗性基因Tm-22的技术体系,开展分子标记辅助选择育种,选育加工番茄抗病品种.[方法]以6份ToMV表现型鉴定已知的加工番茄材料为试材,选用与Tm-22基因连锁的SCAR标记,通过PCR扩增和Hind Ⅲ酶切鉴定有无Tm-22基因,并将其应用于加工番茄品种选育.[结果]抗感试材均产生950 bp和1 100bp的特异片段,纯合抗病基因型无HindⅢ酶切位点,杂合抗病基因型和感病基因型有Hind Ⅲ酶切位点,酶切结果为:纯合抗病1 100 bp+ 950 bp、杂合抗病1 100 bp+950 bp +500 bp +300 bp+ 150 bp、感病基因1 100 bp +500 bp +300 bp+ 150 bp.[结论]通过酶切产生的特异性片段就可鉴定出Tm-22基因,成本低,操作不受时间、地域、发育时期的限制,提高了选择的准确性,加快了育种进程.     

黄瓜白粉病抗性序列相关扩增多态性的分子标记研究

以高抗和高感白粉病的黄瓜亲本及其杂交后代F2分离群体为材料,应用序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)技术开展与黄瓜白粉病抗性基因连锁的SRAP分子标记研究.结果表明:从437对SRAP引物组合中筛选出62对能够在2个亲本抗、感池间扩增出稳定多态性条带的引物组合,进一步用这些引物分析F2群体,发现有1对引物组合Mel/Em9扩增出的SRAP标记(Mel/Em9-284 bp)能与黄瓜抗白粉病基因连锁,遗传距离为9.8 cM.获得的分子标记对克隆抗病基因和利用分子标记辅助选择提高育种效率具有重要意义.     

苹果抗斑点落叶病基因的一个RAPD标记的SCAR转换

将苹果抗斑点落叶病相关基因的一个RAPD标记成功转换为重复性和特异性更好的SCAR标记。由序列特点设计特异SCAR引物,并用所设计引物对两亲本和抗病、感病基因池及F1代单株进行PCR扩增。结果表明,秦冠×富士F1代群体在抗病后代个体中扩增出470 bp条带,而在感病后代个体中无此扩增条带,故将该标记命名为SCAR470。同时,分析分离群体的扩增,重复率为4.69%,表明该标记可以用于苹果斑点落叶病的分子鉴定。