油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9的遗传和基因克隆

【目的】分离和鉴定自然突变的油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9抗性基因,阐明抗性产生的分子基础。【方法】通过配置杂交组合研究其遗传规律,应用同源序列法克隆油菜ALS家族基因,采用杂交转育和小孢子培养技术将抗性基因转育到陆奥-五十铃细胞质雄性不育（MICMS）恢复系中,进行PCR鉴定。【结果】该突变体抗性由1个显性核基因控制。克隆获得BnALS1-BnALS3,核酸序列比对发现,M9抗性是由BnALS1的点突变使蛋白序列的第638位丝氨酸（AGT）残基被天冬酰胺酸（AAT）替代所致,将此抗性基因命名为BnALS1R。抗性基因BnALS1R转育到MICMS恢复系中的PCR检测表明,所有抗除草剂的恢复系都携带有BnALS1R。【结论】突变体M9抗性由1个显性核基因控制,BnALS1第638位丝氨酸突变成天冬酰胺酸是抗性产生的分子基础。     

白菜类作物开花时间相关基因BraA.FLM.a的CAPS标记开发与利用

[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因BraA.FLM.a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的BraA.FLM.a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,并进行Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。[结果]通过调查亲本早开花油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143和晚开花芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044的开花时间和F2群体的开花时间,发现两亲本的开花时间存在显著性差异。通过PCR扩增克隆了两亲本的BraA.FLM.a基因的特异序列,并在突变位点T-A处开发出CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ。在136份F_2分离群体上进行此CAPS标记的验证后,发现T基因型开花时间晚于A基因型的开花时间,并且差异显著(P0.05)。[结论]BraA.FLM.a基因的CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ与开花时间表型显著相关,该标记可以用作开花时间的分子选择辅助育种。     

海岛棉枯萎病抗性遗传规律及分子标记的初步筛选

[目的]研究海岛棉枯萎病抗性遗传规律,并对与枯萎病抗性基因连锁的分子标记进行初步筛选.[方法]以高产、优质、高感枯萎病的海岛棉品种新海21号为母本、高抗枯萎病的海岛棉品系HK237为父本,构建了P_1、P_2、F_1、F_2、F_(2:3)家系、BC_1六个世代群体.在苗期于温室中用人工接菌法对各个世代群体的枯萎病抗性鉴定.[结果]采用BSA法对2 000对SSR引物进行筛选,共获得5对在亲本及抗、感DNA池表现多态性的引物.根据多态性标记对F_2群体基因型鉴定结果结合抗病性表现,利用Mapmaker/Exp(Version3.0b)统计分析软件进行遗传连锁分析.结果表明,标记NAU3240与海岛棉枯萎病抗性位点之间紧密连锁.[结论]海岛棉HK237对枯萎病的抗性遗传受显性单基因控制,表现为质量性状的遗传规律.     

抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究

[目的]携带抗性基因回交后代的适合度是抗除草剂转基因作物的抗性基因能否成功逃逸到野生近缘种的重要依据。本文研究抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的回交3代子1代(BC_3F_2)和子2代(BC_3F_3)在田间条件下的适合度,为转基因油菜基因漂移的生态风险评估提供有价值的参考。[方法]以野芥菜、抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC3F3为材料,研究在低密度(每区15株)和高密度(每区30株)单种及不同种植比例(野芥菜、回交后代的混种比例分别为4∶1、3∶2和1∶1)混种条件下,野芥菜与BC_3F_2和BC_3F_3的总适合度。[结果]单种条件下,BC_3F_2的总适合度均与野芥菜无显著性差异。混种条件下,种植比例为4∶1时,BC_3F_2在2种密度下的总适合度均显著低于野芥菜;在混种比例为3∶2和1∶1条件下,BC_3F_2在低密度条件下的总适合度与野芥菜相当,而在高密度下的总适合度显著低于野芥菜。BC_3F_3在各种种植条件下的总适合度均与野芥菜无显著差异。[结论]BC_3F_2的总适合度受种植密度和比例的影响,在低密度3∶2和1∶1混种比例下的总适合度与野芥菜相当;BC_3F_3的总适合度不受种植密度和比例的影响。抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC_3F_3都具有在野外生存定植的可能性,且BC3F3定植的可能性较BC_3F_2更大。因此在防范转基因油菜基因逃逸的策略上,除防范初始杂交发生外,也应该防范回交后代的产生。     

番茄抗晚疫病基因ph-3的RAPD及CAPS标记

将番茄抗晚疫病ph-3基因已有的RAPD特异片段进行克隆、测序.根据该测序结果设计SCAR引物对抗病亲本、感病亲本、抗病池、感病池、F_1个体进行扩增,均获得一条592bp的特异片段.感病基因型和杂合抗病基因型存在Xba Ⅰ酶切位点,酶切后分别产生了261bp、193bp和95bp以及592bp、261bp、193bp和95bp的特异性片段,纯合抗病基因型无此酶切位点,酶切结果仍为592bp的产物.这些片段能成功区分抗病材料、感病材料和F_1个体,很有可能是与ph-3基因连锁的CAPS标记.     

抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本的Bt基因类型鉴定与染色体定位

为研究抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本YL02-1的Bt抗虫基因类型,抗虫性状遗传方式以及Bt基因在染色体上的插入位置,首先利用特异引物对抗虫亲本YL02-1的Bt基因来源进行PCR鉴定,结果显示,其扩增条带符合国产Bt抗虫基因引物设计的特征片段长度456 bp。而后以抗虫亲本YL02-1与非抗虫海岛棉种质系海7124杂交配组获得F_1,F_1自交获得F_2分离群体。对F_2分离群体的分析结果显示,Bt抗虫基因符合3∶1理论分离比例。进一步利用F2中含有Bt和不含Bt基因的棉株DNA构建近等基因混合池,以覆盖棉花26对染色体的234对核心引物检测混合池,共获得38对SSR多态性引物。将获得的多态性引物检测F_2分离群体基因型,发现分子标记NAU2579与目的基因连锁。已知分子标记NAU2579位于棉花第20染色体,对该分子标记上、下50 cM之内的其他分子标记进行多态性筛选,共获得17个与Bt基因连锁的分子标记,目的基因位于分子标记Gh564和NAU3813之间,其遗传距离分别为2.8 cM和12.2 cM。由此,将亲本YL02-1中的Bt抗虫基因定位于棉花第20染色体上。     

分子标记辅助选育甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂恢复系

选育抗磺酰脲类除草剂的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育(polima cytoplasmic male sterility,pol CMS)恢复系,为培育抗除草剂pol CMS "三系"杂交种打下基础。以甘蓝型油菜pol CMS恢复系2350C为母本与抗磺酰脲类除草剂油菜M342杂交,利用苯磺隆除草剂在F2分离群体中筛选抗性单株,采用分子标记辅助选择纯合抗性植株并与pol CMS不育系测交,鉴定携带纯合pol CMS恢复基因的单株,经过多代自交成功选育了抗除草剂的pol CMS恢复系18Z363,利用18Z363配制的抗除草剂pol CMS "三系"组合中有1个比对照品种油研50增产3. 85%、2个组合与对照产量持平,表明该恢复系具有一定的配制高产组合的潜力。     

油菜抗除草剂性状的遗传及利用

以抗草甘膦油菜“Q3”和MICMS保持系“宁B6”、“宁B7”及恢复系“宁R1”、“宁R3”为亲本材料,配制杂交组合,研究抗性遗传。结果表明,油菜对草甘膦的抗性为显性性状,由1对基因控制,抗草甘膦基因在F_2和BC_1群体遵循孟德尔分离规律。因此,应用杂交、回交育种方法将CP_4 gox双价基因转育到油菜推广品种中是可行的。     

大豆细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记定位

利用组合不育系SXJLCMS1A×恢复系Z-119-99构建F_2育性分离群体,进行育性的遗传模式分析和恢复基因定位。结果表明,F_1群体全为可育株,F_2群体的可育株与半不育株经卡方测验符合1∶1的分离比例,说明该大豆细胞质雄性不育符合单基因配子体不育的遗传模式;利用F_2分离群体,采用445对大豆SSR引物对其恢复基因进行分子标记和定位,结果发现,该恢复基因与J连锁群的2个标记Satt674和Satt249连锁,距2个标记的遗传距离分别为8.7,9.6 c M。     

利用苯磺隆定向转育甘蓝型油菜抗除草剂恢复系18Z82

为选育抗磺酰脲类除草剂的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育(polima cytoplasmic male sterility,pol CMS)恢复系,以pol CMS恢复系2255C为母本与抗磺酰脲类除草剂油菜M342杂交,使用苯磺隆筛选F_2单株及F_(2∶3)株系,结合F_2除草剂抗性单株与pol CMS不育系的测交鉴定,成功筛选到聚合了纯合的除草剂抗性基因和pol CMS恢复基因的株系,经多代自交定向选育出抗磺酰脲类除草剂的pol CMS恢复系18Z82,用18Z82配制的11个组合中有2个组合产量显著高于油研50、有1个组合产量与油研50基本持平,表明18Z82可以用来配制高产抗草剂pol CMS"三系"组合。     

朝鲜牛尿黑酸酶基因的遗传多样性分析

采用PCR—SSCP技术分析了尿黑酶基因（14CO）在朝鲜牛群体中的多态性。结果表明,HGD基因在2对引物扩增片段中均存在PCR-SSCP多态性。P1引物扩增的群体出现了1Tr和CC2种基因型,基因型频率分别为0．90和0．10;P2引物扩增的群体出现了Gc、AA和GA3种基因型,基因型频率分别为0．53、0．07和0．40。测序结果表明,P1引物扩增的片段存在1个g．24581T〉c的突变,落在HGD基因第6内含子上;P2引物扩增的片段存在1个g．29858G〉A的突变,落在HGD基因第10外显子上,并导致了Arg—His氨基酸的改变。2个SNPs形成TG、TA和CG3种单倍型,频率分别为0．47、0．43和0．10。     

利用GS3基因功能性分子标记改良水稻粒型的研究

以长粒品种‘三粒寸'‘IAC1246'‘JAPPENI TUNGKUNGO'和‘MIGA'作为供体亲本,以优良选系SAGC-4作为受体亲本,进行杂交和连续回交,利用GS3基因的功能性分子标记SF28进行BC_1F_1和BC_2F_1的分子标记辅助选择。在不同BC_2F_1单株派生的BC_2F_2分离群体中,观察到粒长性状的典型双峰分布或单峰连续分布。结合田间农艺性状考察,选出89个具备细长粒型且综合农艺性状良好的单株,其中4个优良单株的平均粒长从原始受体亲本的8.32 mm增加至9.84 mm左右,平均长宽比由原来的2.61增加至3.00。结果表明:GS3基因具有控制粒长和长宽比的较大遗传效应,对该基因进行分子标记辅助选择可快速改良亲本的粒型性状。     

陆地棉转GR79与GAT基因对草甘膦抗性的鉴定及其遗传规律分析

本研究采用特异引物对陆地棉种质系GGK-2的抗草甘膦基因进行PCR鉴定,结果显示:GGK-2不仅扩增出488 bp的GR79基因的特征条带,同时还扩增出379 bp的GAT基因特征条带。而后采用草甘膦对陆地棉与陆地棉杂交F_2分离群体进行浸种抗性鉴定,结果显示GGK-2对草甘膦表现出良好抗性,其抗草甘膦性状分离符合抗性株∶非抗性株=3∶1的质量性状分离规律,显示抗草甘膦性状是受孟德尔单显性基因控制的质量性状。同时,利用陆地棉与陆地棉杂交F_2群体对抗性基因GR79和GAT的分离进行PCR检测,显示目的基因GR79和GAT导入棉花后,以共有的方式在棉花杂交后代稳定地遗传传递,共有比率高达97.9%。而后,采用海岛棉与陆地棉杂交F_2群体作为定位群体,利用SSR分子标记对外源基因进行遗传定位,结果显示GR79和GAT 2个基因均被定位于棉花第20号染色体上,并表现为连锁遗传,其遗传距离为3.3 cM。在GR79基因位点一侧有7个SSR分子标记,与其最近的标记为相距7.1 cM的NAU2579;在GAT基因位点一侧也有7个SSR分子标记,与其最近的标记是相距3.9 cM的NAU3137。本研究为品系GGK-2在抗除草剂棉花育种中的应用提供了理论依据。     

西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发

【目的】通过QTL初定位检测栽培西瓜枯萎病生理小种1抗性的主效QTL,验证枯萎病抗性基因Fon-1的存在,结合亲本重测序信息开发紧密连锁易于检测的InDe1(insertion/deletion)分子标记,为西瓜枯萎病分子标记辅助育种提供技术支撑,并实现该QTL的精细定位,加速Fon-1的克隆和功能验证进程。【方法】以高抗枯萎病的栽培西瓜‘ZXG01478'和高感病的栽培西瓜‘14CB11'为亲本构建的F_2群体为试验材料,利用WinQTL cartographer 2.5软件基于复合区间作图法对枯萎病生理小种1抗性进行QTL定位。依据两个亲本材料进行高通量的重测序,并利用重测序信息,获取位于QTL置信区间的InDe1信息,利用自编的Per1程序提取参考基因组中插入缺失相应位置前后500 bp的序列,并利用Primer 5.0软件设计对应的InDe1引物对,开发InDe1标记。利用开发的InDe1标记进行精细定位(根据基因型鉴定结果找到群体中的交换单株,逐步缩小QTL区间)、图谱(利用JoinMap 4.0计算标记的连锁关系)和QTL的重新分析。并利用具有广泛代表性的130份不同抗性的西瓜种质资源的基因型和表型鉴定结果进行验证分析。【结果】F_2群体的病株率频率分布呈现明显的双峰分布且抗病和感病两种类型的株系分离比基本符合3:1的分离比(χ~2=0.52,P=0.47),表明西瓜枯萎病生理小种1抗性主要受一个主效QTL控制。F_2群体的QTL初定位在LG1鉴定到一个枯萎病抗性相关的主效QTL(fon1),其LOD峰值为26.05,解释80.18%的表型变异,置信区间对应的物理位置为1号染色体的193 333-2 775 577 bp。通过两个亲本重测序在QTL置信区间发现19个插入缺失片段大于20 bp的InDe1s,经引物设计与亲本筛选,获得理想引物12对,根据位于端点位置的插入缺失选取了6对InDe1引物利用F_2群体进行验证。初步的精细定位利用群体中的5个交换单株将QTL的置信区间锁定到InDe12_fon1的上游区域,连锁和QTL的重新分析结果显示新开发的一个分子标记InDe11_fon1出现在该QTL的峰值,LOD值为31.65,解释91.46%的表型变异。新开发的分子标记InDe11_fon1与已应用于枯萎病抗性研究的CAPS标记7716_fon在130份不同抗性的西瓜种质资源中的基因型鉴定结果完全一致,且基因型鉴定结果与田间抗病表型性状的符合率达70.8%。利用QTL峰值附近的SNP和InDe1标记与群体中的9个交换单株最终将fon1精细定位至246 kb的物理区间。【结论】主效QTL(fon1)验证了1号染色体上Fon-1的存在,并实现了精细定位。新开发的标记InDe11_fon1与Fon-1紧密连锁,且检测简单,成本低廉,能够更好的用于栽培西瓜枯萎病的分子标记辅助育种。     

油菜品质育种的研究——Ⅳ. 甘蓝型油菜种子中硫代葡萄糖甙总量的遗传及与主要农艺性状的相关

用甘蓝型胜利油菜和Tower进行正,反交和回交,分析了亲本,F_1,F_2,F_3和BC_1F_1,BC_1F_2种子中的硫代葡萄糖甙总量,发现F_1种子主要由母体植株的基因型控制,F_2和BC_1F_1受母体种子硫代葡萄糖甙含量的影响、F_3和BC_1F_2呈连续分布,硫代葡萄糖甙总量受3对基因控制,高含量对低含量为部分显性,硫代葡萄糖甙的遗传力为89.9%(h~2B)和72.7%(h~2N),F_2代硫代葡萄糖甙植株与较差的农艺性状相联系。     

小麦品种对土传小麦黄色花叶病毒病抗性遗传的初步研究

本试验通过杂交、回交和抗病性鉴定等方法,测定了14个组合的F_1代对土传小麦黄色花叶病毒病的抗性遗传。根据双亲正反杂交表现型一致的结果,可以确定控制小麦品种对该病毒病的抗性为细胞核遗传。通过对F_1、F_2、BC_1及BC_2各代群体抗病株和感病株分离比值的分析,初步确定有关土传小麦黄色花叶病毒病的抗性遗传可能受两对致病显性基因(S_1、S_2),和一对抑制基因(I)所控制,作者并对这一问题与前人工作作了比较和讨论。     

甘蓝抗枯萎病SCAR标记的开发

 【目的】开发与甘蓝枯萎病抗性基因紧密连锁的SCAR标记,利用该标记对甘蓝抗枯萎病基因跟踪、鉴定,为甘蓝抗枯萎病分子标记辅助选择奠定基础。【方法】以高抗枯萎病的甘蓝自交系8024与感病自交系6A为亲本构建F2代分离群体和相应F3代家系,通过F3代家系抗病性分离表现确认F2代单株的基因型,选择10株纯合基因型显性抗病单株和10株纯合基因型隐性感病单株,利用BSA法构建甘蓝抗感基因池,筛选出与甘蓝枯萎病抗性基因紧密连锁的AFLP标记,克隆测序后根据序列差异将其转化为SCAR标记,通过142株F2代分离群体连锁验证该标记与甘蓝枯萎病抗性基因的连锁关系,并利用两个不同的抗感分离F2群体共100株对SCAR标记的通用性进行验证。【结果】获得了1个以相斥相连锁的SCAR标记S46M48199,该标记在感病亲本中扩增出199 bp的单一条带,而在抗病亲本中无扩增条带,142株F2代分离群体连锁分析表明,其遗传距离为2.78 cM,在F66和C1两个F2群体中的通用性验证结果,与抗性鉴定结果的吻合率分别为81%和83%。【结论】开发的SCAR标记可用于甘蓝抗枯萎病的分子标记辅助育种。     

甘蓝型油菜胞质雄性不育育性恢复基因的分子标记

以甘蓝型油菜不育系212A和恢复系1521C组配的含144个单株的F2群体为试验材料,用RAPD和SRAP两种分子标记,结合BSA法,对可育DNA池与不育DNA池筛选,存在差异的引物再用分离群体进行检测。在690条RAPD引物、270对SRAP引物中,获得了与甘蓝型油菜恢复基因Rf连锁的1个RAPD标记OPS11-850和1个SRAP标记M17E13-150,标记与基因Rf之间的遗传距离分别为6.8 c M和10.8 c M。     

四倍体马铃著“合作88”PVY、PLRV抗性基因的基因型分析

[目的]分析四倍体马铃薯“合作88”PVY、PLRV抗性基因的基因型.[方法]利用969个自交分离群体株系,采用田间性状调查、DAS-ELISA病毒检测、抗性基因连锁分子标记检测.[结果]田间调查PVY、PLRV抗病与感病的比为968.000∶1和41.130∶1,推测基因型分别为YyYy和RRrr,分离方式为染色单体随机分离和染色体随机分离;DAS-ELISA检测PVY、PLRV阴性与阳性的比为483.500∶1和19.617∶1,推测基因型分别为YYYy和RRrr,分离方式均为完全均衡式分离;分子标记RYSC3检测PVY抗性基因厨曲有特异性和无特异性的比为322.000∶1,推测PVY基因型为YYYy,分离方式为完全均衡式分离;分子标记DMB32-11检测PLRV抗性基因Rlr.b有特异性和无特异性的比为32.414∶1,推测PLRV基因型为RRrr,分离方式为染色体随机分离.[结论]3种试验方法均表明四倍体马铃薯“合作88”PVY抗性基因的基因型是YYYy,PLRV抗性基因的基因型是RRrr,二者在遗传分离时存在多种分离方式.     

F_(2∶3)家系法鉴定大白菜TuMV分离群体单株抗性

为筛选与目的基因连锁更加准确的分子标记以及明确分子标记鉴定技术的准确率,同时为后期进行基因精细定位研究提供技术手段,本试验采用F_(2∶3)家系进行F_2单株的TuMV抗性鉴定。结果表明,122个大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F_(2∶3)家系中,抗病的有98个,感病的有24个,经卡方测验,符合3∶1的分离比例,与以往对该群体F_2代TuMV抗性分离比例的研究一致,表明这种鉴定方法可行。本结果可为今后分离群体单株TuMV抗性的准确鉴定提供参考。