四倍体马铃薯“合作88”PVY、PLRV抗性基因的基因型分析

[目的]分析四倍体马铃薯"合作88"PVY、PLRV抗性基因的基因型。[方法]利用969个自交分离群体株系,采用田间性状调查、DAS-ELISA病毒检测、抗性基因连锁分子标记检测。[结果]田间调查PVY、PLRV抗病与感病的比为968.000∶1和41.130∶1,推测基因型分别为YYYy和RRrr,分离方式为染色单体随机分离和染色体随机分离;DAS-ELISA检测PVY、PLRV阴性与阳性的比为483.500∶1和19.617∶1,推测基因型分别为YYYy和RRrr,分离方式均为完全均衡式分离;分子标记RYSC3检测PVY抗性基因Ryadg有特异性和无特异性的比为322.000∶1,推测PVY基因型为YYYy,分离方式为完全均衡式分离;分子标记DMB32-11检测PLRV抗性基因Rlretb有特异性和无特异性的比为32.414∶1,推测PLRV基因型为RRrr,分离方式为染色体随机分离。[结论]3种试验方法均表明四倍体马铃薯"合作88"PVY抗性基因的基因型是YYYy,PLRV抗性基因的基因型是RRrr,二者在遗传分离时存在多种分离方式。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。     

西宁市马铃薯3种常见病毒的检测分析

为了解西宁市马铃薯(大西洋)PVX、PVY、PLRV这3种病毒的发生情况,从该地区采集了270份叶片样品,应用DAS-ELISA法进行检测。检测结果表明,有26份样品为PVY阳性,此样品中PVY病毒感染率高达9.63%,由此可推测出该地区大西洋品种马铃薯被PVY病毒感染较为严重;有1份样品为PLRV阳性,其感染率为0.37%,说明该地区种植的大西洋品种马铃薯被PLRV病毒感染并不严重;在本次检测中没有出现PVX阳性,其病毒感染率为0,说明该地区大西洋品种马铃薯极不容易被PVX病毒感染。     

贵州3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测与分析

应用DAS-ELISA法对从贵州省马铃薯种植区采集带症状的202份马铃薯叶片分别进行了PVX、PVY、PLRV 3种马铃薯病毒的检测。结果表明,3种马铃薯病毒在贵州马铃薯种植区表现出比较显著的田间症状,其病毒的发生与气候类型、种薯品种来源、种植方式存在相关性,并结合马铃薯实际生产对其病毒防治措施做了简要讨论。     

应用改进的DAS-ELISA法快速检测马铃薯病毒

试验分别用改进DAS-ELISA法和常规DAS-ELISA法对马铃薯4种主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV进行检测,其检测结果完全一致,且灵敏度也基本相同。改进法比常规法操作简便、节省时间,表明改进DAS-ELISA法是一种直观、实用、快速、准确可靠的检测方法,适合种薯生产中大量样品的多种主要马铃薯病毒的快速检测。     

云南马铃薯病毒种类及脱病毒种苗筛选技术体系

应用电子显微镜(负染色观察、免疫电镜、细胞病理)、血清学(DAS-ELISA、TAS—ELISA)的方法,对采自云南省马铃薯产区的2 000多份马铃薯病毒病样品及试管苗、微型薯样品进行了检测鉴定。检出的病毒种类有马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)、番茄斑萎病毒(TSWV)、类烟草脆裂病毒(TRV like)、类马铃薯帚顶病毒(PMTV like)7种,其中PVX、PVY、PLRV是主要毒源。研究了PVY对合作88、PVX对中甸红产量的影响,随着种薯带毒率增加,产量显著下降。应用电子显微镜、TAS—ELISA技术建立了脱病毒核心种苗的检测筛选技术体系。制备了PVY的TAS—ELISA快速检测试剂盒,应用于生产用种苗、种薯的检测。     

水稻细菌性条斑病抗性基因bls2 SSR分子标记开发

【目的】开发水稻细菌性条斑病（简称细条病）抗性基因bls2 SSR分子标记,为利用分子标记辅助选择培育水稻细条病抗性品种提供技术支撑。【方法】基于本课题组前期对细条病抗性基因bls2初定位结果,设计SL03与SL04分子标记区间的SSR引物,从中筛选出在亲本间具有多态性的引物,用于检测由普通野生稻DY19与籼稻9311为亲本构建的BC₃F₂群体中各单株的基因型,并结合细条病病斑长度测定结果,利用MapQTL 5.0精细定位bls2基因,鉴定出与之紧密连锁的SSR分子标记,并比较单标记或双标记的选择效果。【结果】通过田间细条病抗性鉴定发现,BC₃F₂群体抗、感分离符合理论比1∶3的孟德尔单基因遗传分离规律。利用筛选鉴定出的11个多态性分子标记对BC₃F₂群体共244个单株进行单株基因型检测,并结合单株抗性表型值,将细条病抗性基因bls2精细定位于2号染色体上RM13592和RM13599分子标记之间,物理距离240 kb;RM13592和RM13599分子标记在BC₃F₂群体上的分离比均符合1∶2∶1的单基因遗传分离规律。利用单标记和双标记均可有效选择BC₃F₃群体中的感病单株和抗病单株。RM13592和RM13599分子标记辅助选择符合率分别达92.62%和93.44%,使用双标记的选择符合率为93.44%。【结论】RM13592和RM13599与细条病抗性基因bls2紧密连锁,具有易于PCR扩增,易于识别,准确性高的特点,可作为水稻抗细条病育种上分子标记辅助选择的有效标记。     

马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为明确马铃薯病毒病的发生特点,对中国10个马铃薯主产区进行病毒病发生情况调查。随机抽取马铃薯脱毒试管苗、原原种、大田种薯样品共1 330个,应用血清学DAS-ELISA方法对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA 6种病毒进行实验室检测。初步分析了马铃薯各级种薯病毒病的发生情况,并与2004~2006年病毒病的发生情况进行了比较分析。     

青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

贵州省马铃薯S病毒的发生及防治

对大西洋原原种连续繁种的生产试验及其PVX、PVY、PVS、PLRV病毒的DAS-ELISA检测结果表明,在以上4种病毒中,马铃薯感染S病毒的比例最高,危害较严重,针对此现象提出了贵州省马铃薯S病毒相应的防治措施.