油菜(Brassica napus L.)BnPGIP基因克隆及其表达分析

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99％,编码区序列全长9...     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1 的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)对6叶期幼苗进行接种。提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cDNA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。     

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

M342抗除草剂基因CAPS标记的开发与应用

M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。     

转基因高油酸油菜株系W-4种子脂肪酸组成

为研究fad2基因下调表达对油菜种子脂肪酸组成的影响,分析比较了转基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7种子以及非转基因对照Westar种子中的脂肪酸组成。数据显示W-4种子中油酸平均含量为84.61%±1.41%,较对照增加了25.91%,达到极显著水平;亚油酸和亚麻酸含量分别为3.22%±0.56%和3.45%±0.51%,较对照分别下降了80.89%和47.00%,降幅均达极显著水平。此外,W-4种子中棕榈酸平均含量为3.42%±0.18%,较对照Westar下降18.10%,达到极显著水平;而硬脂酸平均含量为1.87%±0.19%,较对照下降了8.33%,亦达到显著水平;W-4种子中廿碳烯酸的平均含量为1.54%±0.06%,较对照平均增幅为18.46%,达到极显著水平;W-4平均芥酸含量较对照略有增加,但不显著。结果表明油菜种子中fad2基因下调表达对种子的脂肪酸合成与积累影响较大,其不仅显著降低种子中多不饱和脂肪酸含量,增加油酸的含量;而且也显著降低饱和脂肪酸含量,并促进长链单烯酸的合成。     

高产稳产化学杀雄两系杂交油菜宁杂559的选育和种子生产技术

宁杂559属甘蓝型油菜中熟品种类型,选自11′6065×11′6068组合。国家油菜试验结果表明,宁杂559株高161.36 cm,一次分枝数7.16个,单株角果数333.72个,角果中长,每角种子数22.54粒,千粒质量3.93 g,芥酸含量0%,硫苷含量23.34μmol/g,含油量45.56%,平均生育期226.50 d。江苏省油菜区域试验结果表明,宁杂559 2年平均产量3 570.15 kg/hm~2,比对照增产16.53%。国家油菜试验结果表明,宁杂559 2年平均产量2 857.43 kg/hm~2,比对照增产14.90%。菌核病发病率为26.72%,病情指数为15.74,抗倒性强,抗寒性中等,适合机收。     

油菜品种宁油26的选育与栽培要点

宁油26是从甘蓝型油菜组合"中双9号×扬6026"中杂交选育而成的常规油菜新品种,属甘蓝型油菜早、中熟品种类型。从选育过程、产量表现、品质性状、抗性表现、特征特性、农艺性状、经济性状入手,总结了油菜品种宁油26的栽培技术、种子选育技术要点。     

优质化学杀雄两系杂交油菜宁杂1818的选育

宁杂1818属甘蓝型油菜中晚熟品种类型,选自"宁油18×088018"组合,其株高178.73 cm,分枝点较高。一次分枝6.48个,主轴约长60 cm左右,单株角果数257.60个,角果长6~7 cm,果喙较长。每角种子数22.05粒,千粒重4.09g;芥酸含量0.50%,硫苷含量19.71μmol/g,含油量45.54%。国家油菜区域试验结果,平均产量3110.40 kg/hm2,比对照增产4.14%;生产试验结果,宁杂1818比对照增产5.95%。该品种抗病毒病,较抗菌核病,抗倒伏能力强。