水稻种子蜡质基因表达分析

为进一步研究蜡质基因在胚乳中表达模式,选用蜡质基因启动子与gus报告基因构建融合基因导入水稻。转基因水稻不同发育阶段种子胚乳GUS活性检测表明,种子发育过程中,蜡质基因表达逐渐从边缘向中心伸展。在水稻开花第2天至第5天对蜡质基因表达量分析结果显示,蜡质基因在开花第3天开始表达,并在开花第5天出现明显增强现象。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

胡麻脂肪酸去饱和酶基因(fads)差异表达分析

为了了解fad基因在胡麻蒴果发育过程中对不饱和脂肪酸的调控,对高、中、低三个不同亚麻酸(C18:3)含量的胡麻品种(’CDC Gold’,‘内亚7号’,’Linola’)进行了不同时期的品质测定,以及脂肪酸去饱和酶2a基因(fad2a)、脂肪酸去饱和酶2b基因(fad2b)、脂肪酸去饱和酶2c基因(fad2c)、脂肪酸去饱和酶3a基因(fad3a)、脂肪酸去饱和酶3b基因(fad3b)的qRT-PCR定量分析。结果表明,随着蒴果成熟,可溶性糖含量呈降低趋势,粗脂肪与粗蛋白不断积累,且差异显著(p<0.05)。fad2a基因、fad3a基因以及fad3b基因在各个时期中的表达符合正态分布。以0 d的蒴果为对照,在胡麻种子形成过程中,‘内亚7号’的三个基因在5 d和15 d的表达量迅速增加,到30 d时急剧减少,15 d的fad2a基因表达量为5.23倍,fad3a基因表达量是fad2a基因表达量的14.52倍,fad3b基因的表达量是fad2a基因表达量的16.14倍,表明这三个基因参与不饱和脂肪酸积累过程。在低亚麻酸含量品种‘Linola’30 d中,fad3a基因是fad2a基因表达量的52.71倍,fad3b呈下调趋势;在高亚麻酸含量品种‘CDCGold’30d中,fad3a基因与fad2a基因的表达量均呈下调趋势,fad3b的表达量为3.92倍;在中等亚麻酸含量品种‘内亚7号’中,fad2a基因表达量降低了0.31倍,fad3a基因是fad3b基因表达量的1.87倍。fad2b基因、fad2c基因熔解曲线不稳定,峰值低,可以在后续试验中继续探索。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

Bna-novel-miR36421调节拟南芥株型和花器官发育的功能验证

MicroRNA参与油菜种子发育、胁迫响应和胚胎发育等多种生物学过程,但其在油菜株型和花器官发育方面的报道还较少。本研究以高/低收获指数油菜中显著差异表达的Bna-novel-miR36421为对象,通过转基因植株表型、靶基因预测、表达量和双荧光素酶报告系统等解析其调控机制。Bna-novel-miR36421与植物miR167家族成员高度同源,可能为油菜新的miR167成员。Bna-novel-miR36421能靶向并抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581的表达。过表达拟南芥植株中,Bna-novel-miR36421的表达量显著上调,而上述4个靶基因的拟南芥同源基因表达量极显著下降。过表达拟南芥植株株型矮小,茎间缩短,叶片高度卷曲;花器官发育异常,雌蕊膨大,雄蕊花丝缩短,花药不开裂,花粉败育。推测Bna-novel-miR36421可能通过抑制Bna.C03ARF6、Bna.C06ARF8、Bna.A09PATL2和Bna.C03DUF581基因表达,进而对油菜株型和花器官的发育起到重要的调控作用。研究结果对解析mi...     

陆地棉中赤霉素合成途径关键酶基因的时空表达变化

为揭示赤霉素合成途径关键酶基因在棉花生长发育过程中的调控作用,利用实时荧光定量PCR方法中的相对定量方法,对中棉所49材料植株体内的赤霉素合成途径相关基因表达量进行了检测分析。结果显示,幼苗期茎组织内除GA2ox1基因外,其余各基因表达量相对较高。开花期根中GA2ox1、GA3ox1、GID1B,茎中CPS1、GA20ox1、GA3ox1、GID1B和叶中GA3ox1基因表达量上调;吐絮期根中GA2ox1和GA3ox1基因表达量上调,其余基因下调,茎中KS、GID1B基因表达量下调,其余基因上调,其中以GA2ox1上调幅度最大,叶中GA2ox1基因表达量下调,其余基因上调。结果表明,开花期,茎中GA20ox1基因的高表达为植株茎的伸长及果枝发育提供必要的活性赤霉素水平,GA3ox1基因可能与开花成铃有关;吐絮期,随着根茎组织的木质化,根茎中GA2ox1基因表达量逐渐升高以降低活性GAs合成,而叶组织中GA3ox1和GA20ox1基因表达量上调,则为棉桃生长发育与脱水成熟提供必要的激素水平。棉花通过改变植株体内赤霉素合成代谢途径关键酶基因的表达量来调控植株的生长发育,且随着生长发育的进行,各目的基因的表达量变化趋势存在一定差异。为深入研究赤霉素对陆地棉的调控机理提供了理论基础,有助于加快利用赤霉素进行品种改良与种质创新。     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

Bna.C02SWEET15通过光周期途径正向调控油菜开花时间

开花时间是作物的重要农艺指标,关系着作物的生育周期和产量。糖转运体作为植物重要的碳水化合物运输载体,作用于油菜开花时间的研究鲜有报道。本研究在油菜FOX-Hunting文库中鉴定了一个与油菜开花相关的蔗糖转运蛋白Bna.C02SWEET15,通过组织表达和亚细胞定位分析,转基因和突变体表型观察,开花关键基因表达水平检测等解析其生物学功能与调控机制。Bna.C02SWEET15在油菜各组织部位均能够表达,在花后30d种子中最显著。Bna.C02SWEET15定位于细胞膜,启动子活性主要在花药和花后30d种子中。在拟南芥中过表达Bna.C02SWEET15使植株开花提前,利于植株开花的光周期关键基因CO、FT、LFY表达明显上升,负调控基因FLC表达量降低。拟南芥突变体atsweet15a和RNAi-Bna.C02SWEET15转基因油菜均为晚花表型。推测Bna.C02SWEET15能够通过光周期途径正向调控油菜开花时间影响油菜的生育周期。研究结果对理解糖转运体在作物中的调控作用,为油菜高产育种提供了基因资源,奠定了理论基础。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

转反义trxs基因小麦籽粒中ABA和GAs含量与穗发芽的关系

以转反义trxs基因两个纯合株系及其未转基因对照小麦品种‘豫麦18’为材料,采用荧光定量RT-PCR、整穗发芽试验和酶联免疫吸附（ELISA）的方法,对小麦灌浆过程中反义trxs基因表达、穗发芽特性及内源激素ABA和GAs含量进行了测定,探讨转基因小麦籽粒中内源激素ABA和GAs含量与穗发芽的关系。结果表明,在种子形成过程中,反义trxs基因能够正常表达,两个转基因株系中内源trxh基因表达量都明显低于对照;转基因株系籽粒中ABA和ABA/GAs含量显著高于对照,平均分别比对照升高了18.39%和23.47%,而GAs含量在花后15～30d较对照有所降低,平均比对照降低了9.14%;花后20、25、30d,转基因株系的穗粒发芽率显著或极显著低于对照,平均分别比对照下降了49.65%、28.2%、27.23%;相关分析表明,穗发芽率与ABA和ABA/GAs含量均呈显著或极显著负相关,与GAs含量呈正相关。由此推断,反义trxs基因导入抑制了小麦内源同源基因的表达,改变了小麦体内ABA和GAs的平衡,使ABA合成量增加,是导致转基因小麦穗发芽率降低的原因之一。     

导入LPAAT和KCS基因对油菜种子芥酸含量的影响

采用农杆菌介导法,以下胚轴为转化受体,将溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）和酮脂酰辅酶A合成酶（KCS）基因导入2种不同基因型（“Drakkar”和“Maplus”）的甘蓝型油菜,共获得247株再生植株,其再生频率分别为15.1%和2.0%。PCR检测和Southern杂交分析证实,外源基因已整合到油菜基因组中,转化频率分别为3.6%和0.7%。种子中芥酸含量因外源基因的导入使零芥酸油菜“Drakkar”提高到10.5%,高芥酸品种“Maplus”提高了5.0%,最高达62.8%。     

Ta6-SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱性

分别构建CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT组成型植物表达载体和rd29A启动子驱动的逆境诱导型表达载体。利用农杆菌介导法分别导入烟草中,获得转基因株系,Southern杂交和Northern点杂交确定Ta6-SFT整合进转基因株系基因组中,并正常转录。以非转基因株系作对照,对2种转基因烟草株系进行干旱胁迫处理,采用半定量RT-PCR分析Ta6-SFT在转基因株系中的表达,同时测定胁迫0 d和18 d果聚糖含量及部分农艺性状。结果表明,含有rd29A启动子的逆境诱导型株系中Ta6-SFT相对表达量比在含CaMV35S启动子的组成型株系中高,而且积累更多的果聚糖;从株高、1/2株高处茎粗、叶面积数据来看,逆境诱导型转基因株系的生长势优于组成型株系,对干旱表现强的耐性。因此,在转基因植物中逆境诱导型表达Ta6-SFT基因将发挥更好的抗逆功能。     

Characterisation of transgenic oilseed rape expressing pea lectin in anthers for improved resistance to pollen beetle

In order to evaluate pea lectin as a resistance factor against the pollen beetle (Meligethes aeneus), transgenic oilseed rape (Brassica napus) has been produced wherein the pea lectin gene expression is driven by a pollen-specific promoter. The aim of the present study was to identify and characterise non-segregating transgenic and non-transgenic lines to be compared in various future tests for benefits and risks associated with such transgenic crop plants. Three doubled haploid (DH) populations (1436, 1440 and 1451) expected to include lectin-producing lines and two DH populations (1443 and 1449) expected to be free of lectin were produced. All five populations originated from different transformation events in the cultivar Westar. The relative amounts of DNA from the marker gene cassette were quantified by conventional as well as real-time PCR analyses and lectin concentrations were estimated by western blot analysis. Two populations with high lectin concentrations, 1436 and 1451, contained higher amounts of the marker DNA and thus more lectin gene copies as compared with 1440 which had lower concentrations of the lectin. As expected all DH lines from 1443 and 1449 were free of lectin. Maximum pea lectin concentration obtained corresponded to 3% of total soluble protein in the anthers. There were significant differences between the populations with respect to bud and flowering stage phenology as well as seed yields, but the differences were not related to their transgenic status. All in all there were 171 lines tested for phenology and transgenic status, out of which 89 with similar phenology were subjected to tests for lectin concentration and seed yield, and 20 of these lines were retested in the next generation. Finally two lines with high lectin concentrations and one with an intermediate level along with two matching non-transgenic lines were selected for future benefit/risk experiments.     

反义trxs基因的导入对小麦种子发芽的影响

用基因枪将反义trxs基因导入小麦幼胚,经组织培养获得了抗性再生植株。PCR及限制酶切检测显示,反义trxs基因在转基因植株中基本完整。生化指标测定及发芽特性试验表明,与对照相比,转基因籽粒中Trx h活性明显降低;水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基含量比率以及α-淀粉酶活性都有所下降;转基因种子的发芽势明显降低,但种子最终发     

反义TRX s基因对转基因小麦籽粒硫氧还蛋白还原活性的影响

以转反义TRX s基因小麦纯合系为材料,分析了转基因小麦TRX h活性和清蛋白、球蛋白、谷蛋白和麦醇溶蛋白各组分及其还原状态的变化。结果表明,不同成熟期转基因小麦籽粒和胚乳中TRX h活性平均比对照降低76.2%和14.2%,其籽粒中的清蛋白、球蛋白、麦醇溶蛋白和谷蛋白巯基含量平均比对照分别低41%、44%、14%和13%,胚乳中分别