动物过敏原牛血清白蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]制备鼠抗牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测动物过敏原BSA含量的间接竞争酶联免疫检测方法(IC-ELISA)。[方法]采用BSA纯品为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗BSA单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定;在此基础上,建立BSA间接竞争ELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。[结果]采用自行制备的特异性抗BSA单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:抗原最佳包被浓度为0.25μg·m L~(-1),单抗最佳工作浓度为1∶32 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶10 000,最低检测限为6.71ng·m L~(-1),线性检测范围为3.593 8~460 ng·m L~(-1)。线性回归直线方程为y=-47.448 9x+135.866 3,相关系数R2=0.997 3,P0.000 1。[结论]该方法特异性强、灵敏度高、可靠性好,适用于食品中过敏原BSA的现场快速检测。     

应用酶联免疫分析方法检测镇江市内水域水样和底泥中的邻苯二甲酸二乙酯

应用邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)抗体,建立了间接竞争性ELISA方法,并对反应条件进行优化,进而测定了镇江市内水域中DEP含量。结果显示优化后的ELISA方法检测范围为20~320 ng·m L~(-1),最低检测限为8.2 ng·m L~(-1)。方法特异性高,与其他邻苯二甲酸酯类似物几乎无交叉反应。ELISA方法批内差在3.38%~9.09%,批间差在3.76%~12.78%。检测方法检测水样和底泥样本中DEP含量,添加回收率在90.46%~122.75%。镇江市内古运河和运粮河水样和底泥样本中DEP的检出率分别为62.5%和87.5%,其中水样中DEP含量最高可为6.61 ng·m L~(-1),底泥样本中DEP含量最高为86.9 ng·g~(-1)。     

双抗夹心酶联免疫分析法检测食品中鸡蛋过敏原

[目的]建立食品中鸡蛋过敏原的酶联免疫检测方法。[方法]以卵白蛋白为检测对象,分别制备抗卵白蛋白的多克隆和单克隆抗体。将单克隆抗体作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记多克隆抗体为二抗构建卵白蛋白的双抗夹心ELISA方法。[结果]该方法的IC50为260 ng/ml,检出限为10 ng/ml,样品的添加回收率为84.2%～89.8%,相对标准偏差小于10%。[结论]该试验建立的分析方法稳定可靠,能满足食品中鸡蛋过敏原准确、快速的检测需要。     

伏马菌素B1胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸条具有较高的特异性和稳定性,操作简单,检测时间仅需10 min,且与高效液相色谱法检测结果一致,可作为检测玉米中伏马菌素B1残留的有效手段。     

固相萃取—高效液相色谱—荧光检测法测定泥蚶中的苯并[a]芘含量

采用固相萃取—高效液相色谱—荧光(HPLC-FLD)联合测定滩涂贝类泥蚶中苯并[a]芘的含量。将泥蚶样品用正己烷超声振荡提取,用苯并[a]芘(B[a]P)专用固相萃取柱(SPE)净化,荧光检测器定量检测。苯并[a]芘在0.01~1μg·m L-1浓度范围内线性相关系数达0.999 2,本方法平均回收率为81.47%~84.71%,相对标准偏差(RSD)为4.8%~8.8%(n=6)。在优化的试验条件下,该方法苯并[a]芘检出限为0.3μg·kg-1;荧光检测器的检出限为1.0 ng·m L-1。总体来看,用该方法检测泥蚶中苯并[a]芘含量前处理简单、分析时间短、具有良好的灵敏度和准确性。     

鸡蛋中硫酸头孢喹肟残留的高效液相色谱检测方法的建立

[目的]为了解硫酸头孢喹肟在鸡蛋中的残留,以确定蛋鸡用药的合理休药期,建立了硫酸头孢喹肟在鸡蛋内的高效液相色谱(HPLC)残留检测方法。[方法]取空白鸡蛋样品,按质量体积比1∶19的比例添加相应浓度的硫酸头孢喹肟对照品溶液制备生物样品,用酸性乙腈提取药物,正己烷分离脂肪,C18固相萃取小柱净化洗脱后,洗脱液经40℃水浴N2吹干浓缩后复溶,在紫外吸收波长270 nm下进行HPLC检测。[结果]硫酸头孢喹肟在0.02~2.00μg·m L~(-1)浓度范围内线性关系良好,回归方程为:y=164.95x+0.693(R2=0.999 8);方法的最低检测限0.01μg·m L~(-1),定量限0.02μg·m L~(-1);药物在生物样品中的低、中、高浓度分别为0.01、0.10和1.00μg·m L~(-1)时,鸡蛋中硫酸头孢喹肟的回收率为85.6%~90.4%,变异系数为6.59%~10.47%,均在规定的药物残留检测添加回收率和变异系数范围内。此外,该检测方法的特异性好、准确度高,24 h内生物样品在室温、4℃(冷藏)和-20℃(冷冻)条件下稳定性均良好,且临床常用抗菌药物不存在干扰。[结论]经方法学验证,本方法适用于鸡蛋中硫酸头孢喹肟含量的检测,可应用于临床的生物样品检测。     

直接进样和柱前衍生2种方法检测水中草甘膦及其降解产物的残留

[目的]本文旨在建立不衍生直接通过液相色谱质谱联用(HPLC-MS/MS)检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法,并对传统柱前衍生HPLC-MS/MS检测水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法进行优化,进而对2种方法进行系统比较。[方法]直接进样法:样品过0.22μm水系滤膜后直接进样检测,以乙腈和16 mmol·L~(-1)氨水为流动相,HSS T3色谱柱梯度洗脱,负离子源模式,HPLC-MS/MS检测;柱前衍生法:样品经过9-芴基甲基三氯甲烷(FMOC-Cl)柱前衍生后过0.22μm水系滤膜,以乙腈和1%甲酸+10 mmol·L~(-1)乙酸铵为流动相,BEH C_(18)色谱柱梯度洗脱,正离子源模式,HPLC-MS/MS检测。[结果]直接进样法:草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200μg·L~(-1)线性关系良好,检出限(以3倍信噪比计)分别为0.104和0.072μg·L~(-1),定量限(以10倍信噪比计)分别为0.348和0.241μg·L~(-1),空白水样2种物质5个浓度水平的添加回收率为81.98%～111.24%,相对标准偏差(RSD)为2.18%～16.52%。柱前衍生法:草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200μg·L~(-1)线性关系良好,检出限(以3倍信噪比计)分别为0.019和0.024μg·L~(-1),定量限(以10倍信噪比计)分别为0.063和0.078μg·L~(-1),空白水样2种物质5个浓度水平的添加回收率为85.56%～110.32%,RSD为0.44%～8.44%。[结论]柱前衍生法和直接进样法都能满足水中草甘膦和氨甲基膦酸的检测要求,前者具有更好的灵敏度,但是需要复杂的衍生步骤,且衍生时间需4 h以上;而直接进样法省去衍生步骤,易于操作,方便快捷。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2、Bax、Bid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。[方法]用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·m L~(-1))对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。[结果]不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·m L~(-1)时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著增加。[结论]DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。     

玉米赤霉烯酮液相芯片定量检测方法的研究

建立玉米赤霉烯酮(ZEN)液相芯片定量检测方法。采用间接竞争法原理和液相芯片技术平台,选用ZEN多克隆抗体对ZEN定量检测方法进行探索。首先将ZEN-BSA与36﹟微球偶联,同时加入待检的游离的ZEN小分子和其标记有生物素的ZEN多克隆抗体,偶联抗原和目标抗原竞争结合生物素标记抗体,通过报告分子SA-PE在532nm波长的激光下,即可检测出报告分子发出的荧光强度,荧光强度与待检ZEN的量成反比。通过优化液相反应体系中ZEN多克隆抗体浓度以及抗原抗体孵育时间,建立了ZEN液相芯片定量检测方法。结果表明:本研究建立的ZEN液相芯片定量检测方法,采用的偶联抗原为ZEN-BSA,偶联量为100μg。ZEN多抗临界饱和浓度为10μg.mL-1,偶联抗原和抗体最佳孵育时间为15h。建立的标准曲线线性方程为y=0.0004x+0.0013(R2=0.9988),以国际通用的IC50作为衡量标准,其最低检出浓度为3.25ng.mL-1,线性范围为0.05~10ng.mL-1。建立的ZEN液相芯片检测方法,快速、灵敏、简便、适用于大量样本的检测。     

光学表面等离子共振测定盐酸克伦特罗的试验研究

为了实现高灵敏度定量检测盐酸克伦特罗,提出了一种新颖的、无标记、快速的内嵌TSPR1K23生物传感器的光学表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)盐酸克伦特罗测定方法,并通过试验验证了光学表面等离子共振生物测定装置的性能.光学表面等离子共振盐酸克伦特罗测定装置由集成光学SPR生物传感器、微流通池、便捷更换芯片的夹具、触电屏,USB接口板及光电转换电路板组成.在光学SPR芯片金膜表面固定盐酸克伦特罗抗原,在标准样品中(盐酸克伦特罗抗体质量浓度33.75 mg·L-1)分别添加0,10,20,40 mg·L-1的盐酸克伦特罗抗原,采用竞争免疫反应方法建立的盐酸克伦特罗测定标准曲线,相关系数0.997,相对标准偏差6.5%.     

兔抗敌百虫多克隆抗体的制备

根据敌百虫的结构特征,将其改造成新的半抗原,并分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,作为免疫原和包被原进行抗体制备及ELISA试验,其抗血清效价达到6.553 6x107.建立了闻接竞争ELISA方法,并优化了工作条件;方阵测定确定了包被抗原最佳浓度为10μg·mL-1,抗血清的最佳稀释度为1:2.048X106;建立了ELISA标准工作曲线,结果表明,在50～3 500 ng·mL-1浓度范围内,标准工作曲线呈线性关系,检测限为60ng·mL-1.     

戊二醛交联的传感器检测布鲁氏菌抗体的研究

[目的]为了检测低浓度布鲁氏菌抗体,实现对布病的早期诊断,建立一种电化学测试方法。[方法]首先采用戊二醛交联未破碎的和超声波破碎的布鲁氏菌病抗原分别固定于预处理后的丝网印刷金电极表面,采用循环伏安法、差分脉冲伏安法和方波伏安法表征了该传感器测试不同浓度的布鲁氏菌抗体的免疫反应过程,构建了电流型无标记免疫传感器。[结果]当抗体浓度为1×10-5~1×10IU·mL~(-1)时,测试的伏安曲线峰电流变化量与抗体浓度对数呈线性函数关系。其中,通过方波伏安法测试后的传感器体系灵敏度最高、检测限最低,为1.206 5×10-9 IU·mL~(-1)。[结论]采用戊二醛偶联方法制备的免疫传感器能有效检测低浓度布鲁氏菌抗体。     

二氟沙星抗体的制备

[目的]制备二氟沙星(DIF)抗体。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法,将二氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原DIF-BSA和检测抗原DIF-OVA,并用DIF-BSA免疫小鼠以获得高效价的抗体。[结果]免疫抗原DIF-BSA的紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特性,其最大吸收峰在波长277 nm处,说明载体蛋白BSA与DIF成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原DIF-OVA的最大吸收峰在波长276 nm处,说明载体蛋白OVA与DIF成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明所得小鼠抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]成功制备了抗二氟沙星抗体,也进一步证明了药物偶联成功。     

可食性动物组织中卡巴氧残留标示物ELISA检测方法的建立

将卡巴氧残留标示物喹喔啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸(ABA)衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸(QCA-ABA),再与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原(QCA-ABA-BSA),将QCA与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被原(QCA-OVA),建立了猪可食性组织中QCA的间接竞争ELISA检测方法。结果表明,最优的QCA-OVA包被抗原浓度为4μg/mL,抗体稀释倍数为1∶3.2×104,最适检测范围为0.2~51.2 ng/mL,最低检测限为0.6μg/kg,对猪肌肉和猪肝脏的添加回收率为47.4%~87.7%。     

抗阿莫西林多克隆抗体的制备

[目的]为研究阿莫西林残留的免疫学检测方法奠定基础。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将阿莫西林分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原AMX-BSA和检测抗原AMX-OVA,用AMX-BSA免疫成年兔以获得高效价的多克隆抗体。[结果]免疫抗原AMX-BSA紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特征,其最大吸收峰在276 nm处,说明载体蛋白BSA与AMX成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原AMX-OVA最大吸收峰在275 nm处,说明载体蛋白OVA与AMX成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明,2只兔抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]该研究成功制备了抗阿莫西林多克隆抗体,也进一步证明药物偶联成功。     

鸡饲料中氢溴酸常山酮含量的反相HPLC检测方法的建立

[目的]本文旨在建立检测饲料中氢溴酸常山酮含量的固相萃取-反相高效液相色谱法。[方法]在鸡饲料中添加一定浓度氢溴酸常山酮,经100 g·L~(-1)碳酸钠溶液碱化后用乙酸乙酯提取饲料中氢溴酸常山酮,0.125 mol·L~(-1)乙酸铵缓冲液萃取,HLB柱净化后供HPLC测定。流动相为体积比5∶3∶12的乙腈、0.25 mol·L~(-1)乙酸铵缓冲液、水溶液(冰乙酸调pH4.3),检测波长243 nm。[结果]该方法对鸡饲料中氢溴酸常山酮的检测限为0.05μg·g~(-1),定量限为0.2μg·g~(-1)。在0.2~15μg·g~(-1)范围内,线性关系良好,其相关系数大于0.999,在0.2、1.0、5.0和15.0μg·g~(-1)添加水平下,鸡饲料中氢溴酸常山酮的回收率为87%~113%,日内变异系数为1.1%~17%,日间变异系数为7.1%~12%。[结论]该方法具有良好的线性关系和较高的精密度、回收率,可以简便、灵敏、快速地检测鸡饲料中氢溴酸常山酮含量。     

液相色谱串联质谱法测定动物组织中17种β-兴奋剂残留

[目的]建立动物组织中β-兴奋剂多残留的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。[方法]样品经提取、固相萃取柱净化后采用LC-MS/MS进行检测分析,对样品前处理条件和质谱参数进行研究。[结果]17种β-兴奋剂的线性范围在0.5~50.0 ng/mL相关性良好,线性相关系数在0.999 88~0.995 70;2种加标水平回收率为63.20%~109.92%和62.99%~112.19%,相对标准偏差(RSD)为0.63%~11.50%和0.33%~8.93%。[结论]该方法稳定、灵敏度高、选择性好,测定结果令人满意,可在各食品检测机构推广应用。     

除草剂丁草胺直接竞争ELISA检测方法研究

制备出3种不同结合比的酶标抗体,对检测条件进行了优化,建立了标记抗体固相抗原直接竞争ELISA(cdELISA)检测丁草胺的方法。结果表明,酶标抗体克分子比为1.55时偶合物活性最高,包被浓度1μg·mL-1,酶标抗体800倍稀释,稀释液采用2×PBS,不含BSA、甲醇,建立的标准曲线IC50=1.7ng·mL-1,检测限为0.006ng·mL-1,检测范围0.06～2616.7ng·mL-1,批内变系数9.25%,批间变异系数23.55%。蒸馏水以及稀释10倍后的矿泉水、池塘水、稻田水添加1ng·mL-1和10ng·mL-1的丁草胺,用所建立的方法检测,平均回收率分别为93.27%、158.50%、119.75%、124.51%。本研究为进一步开发丁草胺免疫分析试剂盒奠定了基础。     

乌头碱抗血清制备与鉴定

通过活性酯法将小分子的乌头碱(ACO)偶联到牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)上,形成偶联物ACO-BSA、ACO-OVA。以ACO-BSA为免疫原,ACO-OVA为检测原,通过ELISA法检测ACO-BSA免疫鼠血清效价,间接竞争ELISA法检测抗体特异性、最低检测限。结果表明,免疫原和检测原均偶联成功,血清效价均大于12 800。间接竞争ELISA法检测结果表明,所获抗体对ACO特异性强,最低检出限为1 ng/m L,IC50值为30 ng/m L,检测范围为1~6μg/m L。     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。