黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带.     

淇河鲫生长激素基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析淇河鲫生长激素(Growth hormone,GH)基因,并进行原核表达。【方法】采用RT-PCR方法对淇河鲫GH基因cDNA进行克隆,对其序列进行分析,并构建其原核表达载体PQE30-GH,进行原核表达。【结果】淇河鲫GH基因长633 bp,与鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼具有较高的同源性,且处于同一进化分支上;与胡子鲇、鳗鲡、家鼠和人等的同源性较低。构建的表达载体PQE30-GH含有GH基因完整的阅读框架(ORF),转化到大肠杆菌DH5α中,经终浓度0.1 mol/L IPTG诱导后成功地表达出24 ku的融合蛋白。【结论】淇河鲫GH基因克隆成功。淇河鲫GH基因可以在原核中诱导表达,但表达量较低。     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

梅花鹿成熟型TGF-β1基因的克隆与结构分析及其在鹿茸顶端组织中的表达

为探究细胞因子对鹿茸再生的影响,提取鹿茸顶端组织总RNA(Trizol法),反转录获得cDNA模板,克隆TGF-β1成熟肽基因。利用生物信息学软件,对其基因序列及蛋白质结构进行分析。结果表明:成功获得梅花鹿TGF-β1成熟肽基因,序列长339 bp,共编码112个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为12.8 kD。同源性分析结果显示,TGF-β1在进化过程中具有高度保守性,梅花鹿与牛、羊、猪、人、鼠的核苷酸序列同源性均90%;除鼠外,梅花鹿与其他物种氨基酸序列并未发生变化。免疫组化结果显示,TGF-β1在鹿茸顶端不同组织中差异表达,软骨层中表达水平最高。由此推测,TGF-β1在鹿茸再生过程中可能发挥重要作用。     

中华蜜蜂王浆多肽Apisimin基因转录、克隆与表达研究

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂头部cDNA文库并进行了测序,从8568个表达序列标签(expression sequencetag,EST)中获得96个Apisimin基因克隆,结果表明Apisimin基因是一个高丰度转录的基因。进一步对克隆分析表明该基因cDNA全长为379 nt,包含一个237 nt、可以编码78个氨基酸的ORF。推导的Apisimin蛋白N端含有一个由24个氨基酸残基组成的信号肽,后端为54残基、预计分子量为5.9kDa的成熟肽。该ORF与意大利蜜蜂和印度蜜蜂的Apisimin基因核苷酸同源性分别为100%和95%。将成熟肽编码区进行亚克隆,构建了Apisimin与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX/apisimin,并将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达。SDS-PAGE和薄层扫描表明,表达的融合蛋白分子量为31 kDa,表达量占细菌总蛋白的22.1%,约50%是可溶性的。通过亲和柱进一步纯化了表达的融合蛋白。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

[研究目的]植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义.[方法]提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA全长序列,并对该序列进行分析.将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达.[结果]克隆到的BanLec cDNA序列为460 bp,开放读码框为426 bp,编码142个氨基酸.与其他已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上.SDS-PAGE分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD.[结论]该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础.     

猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

用逆转录－聚合酰链式反应（RT－PCR）方法，从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素（GH）成熟及基因序列，定向克隆至质粒pUC18，序列分析表明，克隆的猪GH cDNA长573bp，不含信号肽序列，并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220，构建成重组GH基因表达载体pBVpGH7。SDS－PAGE和薄层扫描分析表明：经42℃诱导，pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约2200的特异蛋白，表达量约占细胞总蛋白的20．5％。     

大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA克隆及其真核表达载体的构建

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法克隆大鳞副泥鳅生长激素基因(pGH)cDNA。结果表明,克隆到的pGH的开放阅读框包括633 bp,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,GenBank注册号为DQ350432。把pGH成熟肽的cDNA插入真核表达载体pPIC3.5K,PCR技术、酶切和测序证明重组子中确实定向插入了pGH成熟肽片段;将重组的pPIC3.5K-pGH用SalⅠ酶切后,转化巴斯德毕赤酵母GS115,PCR技术筛选证明pGH已经整合到酵母染色体上。从而成功克隆大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA,并构建了胞内真核表达载体pPIC3.5K-pGH。     

鸡生长激素cDNA及其5''''端调控区的克隆分析

从肉用品种鸡构建的垂体文库中克隆分离了鸡生长激素ｃＤＮＡ,并作了核苷酸序列测定。克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列全长为７８９个碱基对,其中５＇非转译区为４０个碱基对,３’非转译区为１０１个碱基对,编码区为６４８个碱基对。通过序列比较分析,克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列与已报道的蛋用品种鸡生长激素ｃＤＮＡ序列的同源性为９６％,与鸭生长激素序列的同源性为８７％,但与火鸡生长激素序列的同源性只有５２％。通过ＰＣＲ技术,本研究还扩增了６个鸡品种的生长激素基因５’端调控区。尽管这些鸡品种的生产性能差异显著,但序列分析表明鸡生长激素基因５’端调控区十分保守。因而,鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或３’端侧翼序列的影响。另外,鸡生长激素对多人数量性状的影响也在本文中进行了讨论。     

大珠母贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析及应激表达研究

通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了大珠母贝(Pinctada maxima)组织蛋白酶D基因(命名为pmCTSD)的cDNA全长序列1 742 bp,其中5'非翻译区(UTR)38 bp,3'UTR 534 bp,开放阅读框1 170 bp,编码390个氨基酸,分子量约为41.9 ku,等电...     

小菜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与...     

鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆和序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从鲮肝脏总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，克隆至质粒PUGm-T。测定该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆的鲮IGF-IcDNA编码序列包括信号肽、B、C、A、D和E6个区域，共161个氨基酸残基。与鲤IGF-I比较，信号肽由44个氨基酸残基组成比鲤少17个，成熟肽核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.2%和100%,E区域分析结果表明，克隆的鲮IGF-I序列属于IGF-I Ea-2亚型。     

鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆和序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从鲮肝脏总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，克隆至质粒PUGm-T。测定该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆的鲮IGF-IcDNA编码序列包括信号肽、B、C、A、D和E6个区域，共161个氨基酸残基。与鲤IGF-I比较，信号肽由44个氨基酸残基组成比鲤少17个，成熟肽核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.2%和100%,E区域分析结果表明，克隆的鲮IGF-I序列属于IGF-I Ea-2亚型。