苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.     

乳源蜡样芽胞杆菌耐药性、毒力因子检测及分子特征研究

为了解乳品来源蜡样芽胞杆菌携带的毒力因子、分子特征及耐药性,对2016—2019年分离自乳品的122株蜡样芽胞杆菌,采用纸片扩散法（K-B纸片法）测定了分离株对氯霉素、庆大霉素等9种抗生素的耐药性,使用聚合酶链式反应法检测了菌株携带的毒力因子,同时采用脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）检测分离株的分子特征。结果表明,122株蜡样芽胞杆菌均对氯霉素、庆大霉素、阿米卡星敏感;对红霉素、克林霉素和环丙沙星的中介率分别为5.74%、4.92%和0.82%, 9.84%的菌株对复方新诺明具有耐药性,8.20%的菌株对四环素具有耐药性,4.10%的菌株对利福平具有耐药性。122株蜡样芽孢杆菌都检出了蜡样芽孢杆菌的非溶血型肠毒素基因nheA、nheB及肠毒素FM基因entFM;nheC、bceT、cytK、hblA、hblC、hblD、ces和EM1基因的检出率分别为99.18%、37.70%、31.15%、29.51%、24.59%、8.20%、、6.56%和6.56%。122株蜡样芽胞杆菌被分成15簇,未见明显的优势带型。由此可见,2016—2019年收集的蜡样芽胞杆菌乳品分离株携带多种毒力基因,约10%的菌株对复方新诺明、四环素、利福平等具有耐药性,PFGE呈现多种带型,为蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病的预警、预防和治疗提供参考。     

基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界中广泛存在,而且大部分菌株能产生肠毒素和呕吐毒素,是引起养殖动物中毒的常见致病菌。在饲料生产过程中,为对该病原菌进行有效监控,以蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)和肠毒素T基因(bceT)保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计两对特异性引物,建立一种基于实时荧光PCR (real-time PCR)技术的蜡样芽孢杆菌快速检测方法,并对所建立方法的重复性、特异性及灵敏度进行分析。结果表明:所设计的引物可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测而且具有较高的重复性;对8株蜡样芽孢杆菌和8株非蜡样芽孢杆菌共16株菌株进行特异性检测,8株蜡样芽孢杆菌检测全部为阳性,8株非蜡样芽孢杆菌检测全部为阴性,无漏检和误检现象;对纯培养条件下蜡样芽孢杆菌提取的DNA模板进行10倍梯度稀释并进行灵敏度检测,两种肠毒素基因的检测限均为1.0×10~4CFU·mL~(-1);对人工染菌的饲料样品进行检测,在增菌18～20h后进行实时荧光PCR检测,检测限均可达到10CFU·mL~(-1),证明该方法具有良好的特异性和灵敏度,是快速检测饲料中蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

苏云金芽孢杆菌肠毒素的研究进展

苏云金杆菌含有多种毒素,与人畜条件病原菌—蜡质芽孢杆菌有紧密的联系。研究表明用PCR等方法可检测到很多苏云金杆菌含有与蜡质芽孢杆菌类似的多种肠毒素基因,而且,商用肠毒素试剂盒也能检测到有些苏云金杆菌肠毒素的产生,基因核苷酸序列分析表明苏云金杆菌肠毒素基因同蜡质芽孢杆菌肠毒素基因有较高的相似性。该文对苏云金杆菌毒素的基因检测、基因序列分析、活性检测及其安全性方面进行了综述。     

蜡质芽孢杆菌aiiA基因的克隆及融合表达

设计一对可扩增aiiA基因完整的开放阅读框的简并引物对aiiA1和aiiA2,通过PCR技术对3株蜡质芽孢杆菌(Bc)的aiiA基因进行检测.结果表明,它们均含有aiiA基因.利用pMD18-T克隆载体直接从GP7菌株的PCR产物中克隆了aiiA基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号:AY943831)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质推测的分子质量为28 ku,等电点约4.235.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为Bc组aiiA基因(87%-99%).在氨基酸序列多重比较的基础上,应用PHYLIP软件构建了A iiA蛋白的系统发育树.此外,利用原核融合表达载体pMXB10初步研究了A iiA、几丁质结合蛋白(CBD)及Inte in融合蛋白诱导表达的情况.     

防治人参黑斑病与灰霉病的复合芽孢杆菌制剂

从2个不同的人参栽培基地选取健康无病变的人参植株叶片作为筛选生防菌的材料，应用选择性分离法从人参叶片中分离芽孢菌，经染色鉴定、菌落形态鉴定、显微形态鉴定及基因序列分析，筛选出286株芽孢菌，其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)4种菌为优势菌种；制备复合芽孢杆菌制剂，4个菌种的菌株比例n(枯草芽孢杆菌)∶n(特基拉芽孢杆菌)∶n(贝莱斯芽孢杆菌)∶n(地衣芽孢杆菌)约为100∶60∶70∶40;分别用4种优势菌与复合芽孢杆菌制剂做平板，进行对峙拮抗试验，分析4种优势菌与复合芽孢杆菌对人参黑斑病和灰霉病防治效果。结果表明：4种芽孢杆菌及复合芽孢杆菌对黑斑病病原菌均有不同程度的抑制作用。复合芽孢杆菌抑制效果优于单一使用的其中任何一种，复合芽孢杆菌对黑斑病菌、灰霉病菌病原菌的抑制率分别为89.74%、82.26%。用复合芽孢杆菌进行田间试验，复合芽孢杆菌对黑斑病与灰霉病的总体防治效果为65.1%,与代森锰锌总体效果比较无显著性差异；虽然不如...     

一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌NWMCC0137全基因组测序及分析

NWMCC0137是从屠宰场下水道污泥中分离获得的1株高效分解血液蛋白并具有良好生物防控特性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。为探究枯草芽孢杆菌NWMCC0137(B.subtilis NWMCC0137)高效水解血液蛋白机制及挖掘次级代谢产物编码基因资源，利用DNBSEQ与PacBio测序平台对其进行全基因组测序并进行序列组装和基因预测、功能注释、比较基因组分析。结果表明B.subtilis NWMCC0137的基因组长度为4 215 585 bp, G+C含量为44.23%;编码基因总长度为3 711 885 bp,编码4 384个基因，编码序列占整个基因组长度的88.05%,非编码RNA中包含85个tRNA基因。在KEGG数据库中B.subtilis NWMCC0137基因组被注释到7种胞外蛋白酶编码基因，其中与丝氨酸蛋白酶相关的编码基因有8个。通过antiSMASH预测发现，菌株NWMCC0137基因组中包含7种与已知次生代谢产物合成基因簇相似度为100%的基因簇，包括产孢致死因子、聚酮类化合物、丰原素、枯草芽孢杆菌素168、儿茶酚型嗜铁素、芽孢杆菌素、杆菌...     

生防菌FM4B的鉴定及抗菌物质的性质研究

采用生理生化、16S rDNA等方法鉴定菌株FM4B并对该菌株抑菌物质粗提液的性质进行了初步研究.生理生化实验显示,菌株FM4B属于短短芽孢杆菌,16S rDNA基因的测定与分析表明,FM4B与B.brevis(短短芽孢杆菌)的同源性达到99.5%,故推定FM4B为短短芽孢杆菌.实验表明抑菌物质粗提物对多种细菌、真菌有...     

成都市郊区土壤芽孢杆菌的解磷、解钾潜力

采用稀释平板法对成都市郊区27个土壤样品进行了芽孢杆菌的分离,获得333个菌株。在解磷、解钾培养基上分析其解磷、解钾能力。结果表明,约有15%的土壤芽孢杆菌菌株分解无机磷的效果显著,分属15种芽孢杆菌,其中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)为分解无机磷的优势芽孢杆菌。多数菌株也能在有机磷和钾细菌培养基上生长,但分解能力较差。     

多功能芽孢杆菌的分离、筛选及活性测定

从小麦、禾本科杂草根际取样,分离固氮芽孢杆菌,并测定各菌株的抑菌活性及降解有机磷农药的能力,筛选多功能芽孢杆菌菌株.结果表明,分离筛选的11株固氮芽孢杆菌主要包括胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus);其中7株菌株对立枯丝核菌和禾谷丝核菌两种病原菌具有明显的抑菌活性;5株菌株能有效降解甲胺磷和甲基对硫磷两种有机磷农药.巨大芽孢杆菌BM3和地衣芽孢杆菌BL6具有明显的固氮、抑菌和降解有机磷农药等多种功能活性.     

源自动物粪便苏云金芽胞杆菌的cry基因型鉴定

从5种草食性哺乳动物的粪便中筛选获得8株苏云金芽胞杆菌(Bt);并用聚合酶链式反应—限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定体系鉴定各菌株的cry基因型.结果表明:BRC-WCB1、BRC-WCB2、BRC-WCB3、BRC-WCB8同时含有cry1和cry2基因;BRC-WCB6仅含有cry1I基因;BRC-WCB5含有cry3基因,但未出现预知的酶切条带;而BRC-WCB4无任何PCR扩增产物.     

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的检测与杀虫活性测定

为获取高活性的野生Bt菌株,对从土壤中分离的99株Bt菌株进行了营养期杀虫蛋白的分子鉴定和生物活性测定。根据已知的vip3 A基因序列设计1对特异性引物,进行PCR鉴定,55株扩增得到1.2 kb的目的片段。对31株阳性菌株的营养期杀虫蛋白活性进行了初步测定,结果显示,Bt LS1和LS8菌株毒力最高,2菌株对2龄甜菜夜蛾的体重抑制率分别为91.14%和93.59%。选取Bt LS1和LS8菌株进行胞内外营养期蛋白杀虫活性测定,发现Bt LS1和LS8菌株对初孵甜菜夜蛾体重抑制率分别为45.1%和43.2%,对初孵棉铃虫的校正死亡率分别为(22.1±1.4)%和(55.3±3.7)%,对2龄棉铃虫的体重抑制率分别为(78.7±6.6)%和(50.4±2.4)%。     

烟草甲虫高毒力苏云金杆菌的分离与筛选

对云南7个优质主产烟区收集的450份烤后烟样,运用4%NaCl培养基选择分离法,分离出苏云金芽孢杆菌475株。其中对含毒蛋白基因cryⅠ及cryⅤ的18个Bt菌株用2龄烟草甲虫进行生物毒力测定,试验9 d后,9个Bt菌株生物毒力测定校正死亡率均超过80%;试验12 d后,5个Bt菌株生物毒力测定校正死亡率均超过95%。同时对分离出的Bt菌进行PCR毒素蛋白基因鉴定,含cryⅠ毒素蛋白基因的Bt菌有7株,出菌率为1.47%;含cryⅤ毒素蛋白基因的Bt菌11株,出菌率为2.32%;没有含cryⅢ毒素蛋白基因的Bt菌。因此,为进一步用苏云金芽孢杆菌防治烟叶仓贮害虫提供了科学依据。     

桂林猫儿山苏云金芽孢杆菌的筛选及抑菌性研究

[目的]探明桂林市猫儿山风景区Bt的多样性和分布概况.[方法]在该景区海拔1 800 ～2 000 m的常绿针阔叶林和海拔2 000m以上的灌丛矮林采集土壤样品共1 168份,分离Bt菌株,并对Bt分离株进行伴孢晶体蛋白分子量的测定和发酵上清液抑菌性分析.[结果]从该景区针阔叶林和灌丛矮林的146个样点共筛选出44个Bt菌株,出菌率达30.14％;其中14株Bt菌株均表达120 kD的蛋白,12株表达66 kD的蛋白.将14株Bt分离株的发酵液上清进行抑菌检测,仅有4株对草生欧文氏杆菌有抑制效果,其中9号的Bt分离株抑制率最高.9号Bt分离株发酵液上清的抑菌物质热稳定性研究结果表明抑菌物质在65℃下2h内不失活,其至少含有2种抑菌物质.[结论]为丰富我国西部地区Bt资源的开发利用奠定了基础.     

污水、污泥中苏云金杆菌的分离及其基因型鉴定

从40个样品中分离到112株芽孢菌,其中有2株为Bt,占1.8%;从城市污水和啤酒厂生物处理系统中分别分离到1株Bt:采用cry1-cry11、cyt、vip3A、aiiA和inhA引物对BRC-WLY1和BRC-WLY2进行PCR扩增,发现2株Bt含有cry1(cry1Ag、cry1Ba、cry1Gb、cry1La)、cry2Ac、vip3A、aiiA杀虫基因,其中BRC-WLY1还含有inhA基因.     

金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布的研究

为了研究g型肠毒素基因(SEg)i、型肠毒素基因(SEi)在金黄色葡萄球菌菌株中的分布状况,本试验以分离自人化脓组织、生牛乳等8种不同来源的371株金黄色葡萄球菌菌株作为研究对象,利用PCR技术对肠毒素基因的分布进行检测。结果表明:267株金黄色葡萄球菌检出含有肠毒素基因,总检出率为71.97%。其中SEg基因的总检出率为67.93%,SEi基因的总检出率为57.68%。各来源间金黄色葡萄球菌肠毒素的检出率不同,且同一来源的菌株其SEg和SEi的检出率也不同,表明不同来源以及不同肠毒素的基因型在金黄色葡萄球菌中的分布存在差异。     

Geographical Distribution of Bacillus thuringiensis Strains and vip3 Genes in Different Climatic Zones in China

Vegetative Insecticidal Proteins(VIPs),a large family of insecticidal proteins,are produced from Bacillus thuringiensis (Bt) during the vegetative growth stage. VIPs represent the second generation of bio-insecticides that confer a wider insecticidal spectrum and have stronger activity.This work compared the geographical distribution of Bt strains and their vip3 genes in different climatic zones in China, the tropical (Hainan Province), subtropical (Guangxi Province) and temperate zones (Heilongjiang Province). A total of 156 Bt strains were isolated from 841 soil samples in Hainan Province tropical region, 356 Bt strains from 1 420 soil samples in Guangxi Province and 167 Bt strains from 1 010 soil samples in different geographical regions in Heilongjiang Province. Twenty-two out of 156 strains from tropical Hainan Province and two out of 356 from subtropical Guangxi Province were found to express vip3 genes,while vip3 genes were not expressed from temperate zone in Heilongjiang Province.Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)was used to identify different types of vip 3 genes that were within the same family and three full-length vip3 genes were isolated.The genes cloned from Bacillus thuringiensis strain SL3 expressed in the transformed E.coli BL21 strain. Through SDS-PAGE, 88.6 ku insecticidal protein was expressed. The bioassays used two-instar larva of Lepidoptera insects (Spodoptera exigua and Agrotis ipsilon)were performed.The results of the bioassays showed that the protein strongly inhibited the body weight increasement on Spodoptera exigua and Agrotis ipsilon in a standard bioassay.Taken together,the results indicated that the distribution of Bt strains and vip3 genes had regional preference.Tropical and subtropical regions were the rich resources of Bt strains and vip3 genes compared with temperate region.These results would undoubtedly facilitate the studies of insecticidal proteins and expand the list of the pest-killing candidates to make fully use of the extremely rich microbial resources.The new vip 3 genes isolated in the current study might also help resolve the emerging insecticidal resistance problems.     

苏云金芽孢杆菌新疆分离株cry3基因的克隆和序列分析

从新疆天山北坡土壤及昆虫上分离到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株对鞘翅目害虫具有高毒力,其总DNA约为15 kb,以此为模板,并设计特异引物,扩增出800 bp和550 bp DNA片段,将回收的片段与pBS-T质粒连接,转化大肠杆菌（Escherichia coli）,用蓝白斑法筛选,将阳性克隆子（1号-5,700 bp左右、G4号-3,500 bp左右、G4号-4,720 bp左右）测序,与GenBank中已知的序列进行比对,结果表明1号-5与cry3基因家族的杀虫蛋白基因序列同源性可达84%~100%。     

三亚地区苏云金芽孢杆菌的筛选与生物活性测定

[目的]从来自三亚地区的102份土壤样品中筛选苏云金芽孢杆菌,并进行生物活性测定。[方法]采用温度筛选法进行苏云金芽孢杆菌的分离,采用形态观察、生物活性分析手段对菌株进行研究。[结果]经过筛选获得21株菌株,分离频率为20．6％,镜检可观察到球形、菱形、方形、不规则形等主要形态的伴孢晶体。室内生物活性测定结果表明：J24-1菌株对小菜蛾具有高感染力。[结论]分离到的菌株产生的伴孢晶体形态各异,体现了三亚地区Bt资源的多样性;出土率较高说明三亚地区可能蕴含着大量未知的Bt资源。