FPV 4b核心蛋白基因的克隆及其探针制备

利用PCR方法成功克隆了FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段。序列分析表明:该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列同源性为99.5%,只有7个碱基差异(第215位C→A,第386位T→A,第388位G→A,第1 014位T→G,第1 034位T→G,第1 137位C→T,第1 143位A→G)。回收FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒pMD18-T-4b,用EcoRⅠ酶切pMD18-T-4b后得到1个约360 bp大小的DNA片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100 mg/L。敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10 pg。特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

亚洲玉米螟幼虫P450基因片断的克隆与序列分析

根据G enB ank中昆虫P 450氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以亚洲玉米螟田间自然种群基因组DNA为模板,扩增得到一条长度为603 bp的特异性DNA片段,编码201个氨基酸。将此氨基酸序列与G en-B ank中已知序列采用B last及C lusta lW EB I软件进行同源性分析,结果表明该氨基酸序列与CYP 4家族的同源性较高,达37%~53%,初步推测此序列为CYP 4家族的一员。     

核桃举肢蛾线粒体CO I和Cytb基因片段序列分析

核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei）是危害核桃果实的主要害虫,严重影响核桃的产量和商品价值。在最新的形态学分类上,核桃举肢蛾属于鳞翅目、麦蛾总科、黑展足蛾属。通过同源序列比对探讨利用DNA条形码技术（DNA barcoding）对核桃举肢蛾进行分类鉴定的准确性。运用2对通用引物分别扩增核桃举肢蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（CO I）基因和细胞色素b（Cytb）基因片段,并与鳞翅目麦蛾总科、巢蛾总科、凤蝶总科、螟蛾总科等昆虫的同源片段进行碱基组成多样性和系统进化分析,扩增得到核桃举肢蛾CO I基因664 bp片段和Cytb基因479 bp片段。结果表明:核桃举肢蛾线粒体CO I基因片段中,A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为29.5%、39.4%、15.1%和16.1%,A+T的含量(68.9%)明显高于G+C含量（31.1%）,存在显著的AT使用倾向性。在Cytb基因片段中, A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为33.4%、41.5%、10.2%和14.8%,A+T的含量为74.9%,也明显高于G+C含量（26%）。两段序列都以T-A间颠换和T-C间转换为主要替换方式,且密码子第2位点保守性最强,第3位点变异率最高。基于CO I和Cytb基因片段构建的NJ系统进化树均显示核桃举肢蛾与麦蛾总科昆虫处于同一个分支之下。利用DNA条形码技术得到的核桃举肢蛾分子生物学分类结果与传统的形态学分类结果一致。     

多重PCR同时检测鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG方法的建立和临床应用

通过建立针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断技术,并进行了特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明：设计的5对引物对同一样品中的RNA（AIV、NDV、IBV）和DNA（ILTV、MG）进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp（AIV）、321bp（NDV）、457bp（IBV）、662bp（ILTV）和732bp（MG）。说明该多重PCR技术具有较强特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pg IBV的RNA和1pg ILTV、10pgMG的DNA。对自然感染鸡临床样品检测的结果则证明,该技术在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

基于多个核基因序列的1株皮伞属菌株的鉴定

提取在北京市房山地区野外环境中采集的1株野生菌子实体的基因组DNA,并以此为模板进行ITS、LSU和SSU片段的扩增、测序及比对分析。结果发现,从菌丝体基因组DNA中扩增获得了700 bp左右的ITS片段、850 bp左右的LSU片段和1 800 bp左右的SSU片段,经序列测定及比对,表明该真菌是Marasmiellus属菌株。建立了一种野生真菌快速、准确的鉴定方法。     

普通小麦抗条锈新种质—体克2号的抗性遗传分析

对普通小麦抗条锈新种质-体克2号进行了遗传学分析和RAPD标记研究。结果表明,体克2号对条中32号生理小种的的抗性是由1对显性基因控制的。RAPD分析筛选出重复性强、在抗病亲本和抗性基因池稳定出现的特异DNA片段2个,即引物S369的扩增片段和引物S1397的扩增片段,其长度分别约为770bp和1400bp。利用Mapmaker3．0对引物S369扩增出来的特异片段与目的基因的遗传连锁性进行分析,该多态性差异与目的基因的连锁距离为10．4cM。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

苹果 MD-ACO1启动子的克隆

以苹果（Malus pumila Mill．）品种“皇家嘎拉”（Rolay Gala）叶片为材料,采用 CTAB 的方法提取总 DNA。根据 GenBank 中已发表的苹果 ACO1启动子的 DNA 序列,设计引物。采用 PCR 法,克隆该启动子的 DNA 片断。得到了长度分别为953bp 和975bp 的 DNA 片段。DNA 测序分析软件分析结果显示：该序列与已登录的片断的核苷酸序列一致性分别为98％、97％,认为该基因为苹果 ACO1的启动子序列。     

西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因启动子序列的克隆与序列分析

以陕西省千阳县种羊场的足月正常分娩、健康的西农萨能羊为试验材料,运用PCR方法对其FASN基因启动子部分序列进行了克隆和序列分析,获得了西农萨能羊FASN基因启动子序列片段719 bp(GenBank收录号EF556550.1).序列分析显示,TATA盒位于-35 bp处,1个类似于CAAT盒的序列位于-68 bp处,这些都是典型的真核生物启动子元件,TATA盒上游区域有76％以上的G/C含量和4个GC盒(GGGCGG和CCGCCC),潜在的核转录因子结合位点Sp1位于-99 bp、-174 bp、-255 bp和-320 bp.     

基于DNA条形码的一株硬皮马勃菌的鉴定

本研究通过基于DNA条形码的分子鉴定方法对广东省广州市白云山风景区一株马勃菌进行精准鉴定。以野外采集的子实体提取的基因组为模板,扩增ITS和EF1α片段,并进行测序及系统发育分析。获得了600 bp左右的ITS片段和500 bp左右的EF1α片段,经分子系统学分析表明该硬皮马勃菌为Scleroderma sinnamariense,从而对该真菌进行了基于DNA条形码的精准鉴定。     

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

中华蜜蜂mrjp3基因cDNA的克隆及序列分析

 以东方蜜蜂（Apis cerana）mrjp3基因部分片段为探针筛选中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库，得到120个阳性克隆。对这些阳性克隆进行进一步的筛选和序列测定，获得含有中蜂MRJP3 (AccMRJP3)cDNA的阳性克隆，对阳性克隆的插入片段进行测序，得到AccMRJP3的cDNA序列全长。中蜂MRJP3的cDNA全长为1 987 bp（包括10 bp长的poly A尾巴），包含一个长1 779 bp，编码593个氨基酸的ORF，在5'端和3'端各有一个长46 bp和160 bp的非编码区。类似于西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata），由AccMRJP3 cDNA编码的氨基酸序列也存在一个长片段重复区。但比较结果显示中蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂MRJP3重复区之间存在一定差异。     

棕榈科植物基因克隆方法的优化

【目的】优化棕榈科植物基因克隆方法,为其基因组学研究和分子育种奠定基础。【方法】通过优化DNA提取和目的片段回收步骤,检测其对提取DNA质量和纯度、目的片段回收率与阳性克隆等的影响。【结果】DNA提取方法优化后,提取获得的DNA完整性好,无杂质、无弥散现象,质量较好,其OD260/OD280在1.88-1.93;优化前不同样品提取的DNA仅为40.0-60.0 ng/μL,优化后样品DNA在104.5-214.8 ng/μL,为优化前的2-3倍;目的片段回收方法经优化后,可以从扩增的PCR产物中回收获得条带较清晰的目的片段,其胶回收率较高;对回收的目的片段进行亚克隆,以gyspy74引物鉴定阳性克隆,每个样品的菌落均在700 bp左右扩增获得清晰的目的条带,且其中3个菌落的目的条带测序结果与预期核酸序列一致。【结论】优化后的方法适用于棕榈科植物基因克隆。     

长牡蛎钙调蛋白基因克隆及多态性分析

[目的]从钙调蛋白(CaM)基因克隆和序列分析入手,对长牡蛎CaM基因的功能进行深入研究,为生产实践提供参考依据.[方法]利用SMART RACE和EPIC-PCR技术克隆长牡蛎CaM基因,然后采用PCR-SSCP技术和DNA测序方法分析长牡蛎CaM基因编码区多态性.[结果]扩增获得长牡蛎CaM基因cDNA全长序列为917 bp,包括开放阅读框(ORF)全长450 bp,编码149个氨基酸;5′非编码区含222 bp,3′非编码区含245 bp; ORF内有3段内含子序列,分别为Intron-1:110 bp、Intron-2:137 bp和Intron-3:143 bp.PCR-SSCP分析获得C5引物野生型TT型、突变型GG型和杂合型GT型3种基因型.基因型和等位基因频率统计结果表明,GG型和G等位基因频率明显高于TT型和T等位基因;而最小二乘分析结果表明,CaM基因位于ORF内第158位T→G的SNPs位点,对长牡蛎的壳重有显著性影响(P<0.05),但对壳长、壳高、壳宽、体总重及肉重无显著影响.[结论]CaM基因对长牡蛎贝壳形成具有一定的影响作用.     

日本蟾蜍皮肤claudin-4 cDNA的克隆与序列分析

为研究日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（PCR）对日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到2条claudin-4全长cDNA序列（GenBank登录号为JX481975和JX481976）,并对它们进行生物信息学分析。日本蟾蜍claudin-4的2条cDNA全长分别为1 707 bp和1 697 bp,开放阅读框均为630 bp,其中虽有5个碱基不同,但编码的209个氨基酸完全相同。两者的5端非翻译区域序列长度不同,前者为50 bp,后者为41 bp,3端非翻译区域则分别为1 027 bp和1 026 bp。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍claudin-4与非洲爪蟾Xenopus laevis的同源性最高,为88％,与其他7种动物的同源性介于65%~72%。克隆到2条日本蟾蜍claudin-4基因的cDNA序列,为今后研究日本蟾蜍Claudin-4 生物学功能奠定了基础。图5参21     

广西流行狂犬病毒糖蛋白基因的遗传性分析

[目的]通过测定广西流行狂犬病毒糖蛋白(G)基因的全序列,了解广西狂犬病的流行趋势和遗传变异规律,为制定广西狂犬病的防控策略提供科学依据.[方法]2000年10月~2007年10月,从广西14个市采集1569份动物脑组织,经RT-PCR检测及小白鼠脑内接种试验分离狂犬病毒,然后对狂犬病毒G基因进行测序分析.[结果]从广西各地共分离获得26株狂犬病毒野毒株,其中犬23份,牛、猪、猫各1份.狂犬病毒G基因核苷酸全长2067 bp,开放阅读框1575bp,编码524个氨基酸.根据G基因核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,可将广西流行的狂犬病毒株分成3个群,Ⅰ群15株,其核苷酸同源性为97.7%~99.9%; Ⅱ群10株,其核苷酸同源性为98.0%~99.9%; Ⅲ群只有1株.通过氨基酸变异分析,了解了26株野毒株G基因编码蛋白的氨基酸突变位点.[结论]广西存在3个群的狂犬病毒野毒株,且以Ⅰ群和Ⅱ群流行为主,3个群的氨基酸变异均呈现明显的特异性.     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究（摘要）

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及引物步移法（primer-walking）的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,具体步骤：通过已经发表的部分猪脂联素基因cDNA序列设计特异引物用于BAC克隆的筛选。以超级池DNA为模板进行第1次PCR反应,筛出含阳性克隆的超级池;以挑出的阳性超级池的3维池DNA为模板进行第2次PCR反应,根据阳性板池、列池、行池序号得到可能的阳性克隆号;依照阳性克隆号从工作文库中取出相应的BAC克隆,平板划线37℃倒置培养20 h。待菌落长好后,做菌体PCR鉴定,以确认克隆的正确性。将获得的BAC阳性克隆平板划线,37℃摇菌过夜培养,进行BAC的提取、纯化与酶切回收。先以M13引物向BAC两端测序,再以发表的cDNA序列外显子1设计测序引物采用primer-walking的方法,获得连续的DNA序列。采用PCR-RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行分析。[结果]脂联素基因的5′侧翼区-1 010 bp（G/A）的SNP位点,本地猪种中GG基因型频率明显高于外来猪种;-394 bp（T/C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种中却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1 010 bp（G/A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394 bp（T/C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关。     

天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3的克隆及其在烟草中的表达特异性

报道天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3,大小为1 548 bp。经测序分析,与GenBank中登录的海岛棉（Gossypium hirutum L.DES119）特异表达启动子序列同源性为99%,仅有个别碱基发生改变,而启动子的基本元件未发生突变。将克隆的启动子与报告基因GUS融合,构建植物表达载体pBI-LTP3,...     

鸡堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的免疫学筛选

[目的]寻找鸡球虫保护性抗原基因,为研究基因功能和研制抗鸡球虫疫苗奠定基础.[方法]将纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊于兔皮内多点注射,制备堆型艾美耳球虫抗血清,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其效价,进行免疫学筛选.利用PCR对获得的阳性克隆进行初步鉴定.[结果]间接酶联免疫吸附试验结果表明堆型艾美耳球虫抗血清检测结果呈阳性,初步筛选到的疑似阳性斑经3次复筛后获得6个阳性克隆,1～3号克隆约为1 000bp,4～6号克隆约为1 500 bp.[结论]对堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cD-NA文库获得的阳性克隆成功进行了免疫学筛选.