华北落叶松冷驯化与非冷驯化mRNA差异显示初步分析

以华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)幼苗为研究材料,采用冷驯化和非冷驯化两个处理分别提取RNA,然后逆转录成cDNA,PCR扩增,6%变性丙烯酰胺测序胶电泳,银染显带。结果表明:华北落叶松冷驯化与非冷驯化基因表达有一定差异,经二次扩增初步确定冷驯化处理的扩增产物中在500bp处有一条抗冻特异带。同时,对冷驯化不表达片段进行了分析。     

mRNA差异显示法筛选环磷酰胺致突变相关基因的初步研究

为建立在药物致突变研究中应用银染mRNA差异显示的方法,试验提取未经过和经过环磷酰胺处理的BALB／e小鼠脾组织的总RNA,并以此为模板,采用dT12CG、dT22AG、dT12GG为锚定引物,通过反转录、差异显示PCR反应,6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带,回收后将其再扩增。对扩增条带进行克隆、测序。经Blast搜索,发现2条新的基因片段,为进一步研究致突变效应奠定了基础。     

AA肉鸡补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的cDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1.0 kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT-PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

AA肉鸡补体C3d基因eDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的eDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT—PCR扩增出C3d基因的eDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d—pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1．0kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT—PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

mRNA差异显示分离棉花抗旱耐盐基因的相关cDNA片段

采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,对抗旱、耐盐棉花品种(品系)分别进行25%PEG6000和1.3%NaCl胁迫诱导,利用优化的蛋白酶K法分别提取胁迫与非胁迫棉花叶片中的总RNA,以此为模板,选用12个锚定引物和20个随机引物的240个组合进行RT-PCR,产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染,共获得88条差异条带,二次PCR扩增,选择出41条表达稳定的差异条带。     

一种全长cDNA抑制缩减杂交方法及其水稻诱导表达基因分离的应用

以缩减杂交的原理和SMART cDNA合成方法为基础,开发了一种全长cDNA缩减杂交方法.该方法从微量的2个RNA样品合成全长cDNA,经PCR扩增和在两端连接不同的接头,通过2次缩减杂交获得含有高度浓缩的差异表达的全长或较大的基因片段,克隆后筛选出差异表达的基因.以噻菌灵(Probenazole,PBZ)为诱导剂处理水稻,获得了2个上调表达和1个下调表达基因的较长的cDNA片段.     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

利用DDRT-PCR研究丝羽乌骨鸡与AA肉鸡肝脏基因表达的差异

利用mRNA差异显示技术研究丝羽乌骨鸡(SK)与引进的快大型肉鸡品种爱拔益加肉鸡(AA)之间肝脏组织基因表达的差异.采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段,利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段的重扩增产物成分的单一性,采用反向Northern斑点杂交技术对获得的差异显示cDNA片段进行了差异真实性的鉴定.共获得了丝羽乌骨鸡与AA肉鸡差异表达cDNA片段38条,其中26条为丝羽乌骨鸡肝脏表达,而AA肉鸡不表达;其余12条为AA肉鸡肝脏表达,而丝羽乌骨鸡不表达.该结果为进一步研究丝羽乌骨鸡特异基因的表达探索了一种可行的方法,并积累了一定的基础资料.     

葡萄糖转运基因在奶牛乳汁中的表达研究

为了探讨牛乳中葡萄糖转运相关基因的表达,采用牛初乳作为实验材料,运用分子生物学相关实验和技术,进行乳汁体细胞的提取及RNA的提取、反转录和扩增,对牛乳汁中葡萄糖转运相关基因的表达进行了研究。结果：牛初乳中含有大量的体细胞（SCC为20万／mL,台盼蓝拒染测得活力为60％）,可以利用提取的体细胞进行细胞分析以及RNA的提取,所提取RNA的完整性和纯度可以用来合成cDNA,看家基因GAPDH扩增条带清晰。以上结果表明所合成的cDNA可以作为模板进行基因扩增,进行牛乳汁中葡萄糖转运相关基因表达的研究。     

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.