重庆北碚桑树萎缩病植原体分子鉴定

运用16S rDNA基因分子检测技术,使用16m F2/R16mR1,R16F2n/R16R2引物对扩增采集于重庆北碚地区表现萎缩病症的桑叶样品的总DNA,结果发现在编号为C,I,S的样品中扩增出了约1.2 kb的特异条带.经克隆测序并通过NCBI比对分析后,确定所得序列为植原体的特定序列16S rDNA,将测序结果与已报道的桑树萎缩病植原体序列进行同源性比对,结果表明重庆北碚地区桑树萎缩病植原体均属于16S r I亚组,其中C样品中萎缩病植原体鉴定为B亚组.研究结果为明确北碚地区桑树萎缩病病原及该病害的有效防治提供了基础依据.     

基于rbcL序列的半边莲与通泉草的分子鉴别方法

市场流通中半边莲容易与通泉草相互混淆,拟基于rbcL序列建立半边莲与通泉草的分子鉴别方法。采集不同产地的半边莲样品9份,通泉草样品7份,所有受试样品提取总DNA。对其叶绿体DNA中rbcL片段进行扩增、测序,用ClustalX 2.1软件进行多重序列比对后,应用Meg 5.0软件构建NJ系统聚类树进行聚类分析,根据二组样品间的SNP位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并应用SYBR Green I染料法建立对2种中草药进行快速检测的方法。本研究建立了对半边莲与通泉草2种中草药进行分子鉴别的方法,并建立了荧光快速检测方法。     

基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)16SrRNA基因序列设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法。以建立的PCR方法对RA、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭源金黄色葡萄球菌、两双歧杆菌、短乳酸杆菌、屎肠球菌和短小芽孢杆菌进行检测,结果只有RA DNA能扩增出844 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;从凝胶中回收DNA条带,测序结果与GenBank中RA相应序列完全一致。对不同稀释度的RADNA样品进行扩增,PCR对RA DNA最小检出量为22 pg,最少检出RA 80 CFU/mL。以该PCR方法对可疑为RA的临床病料和菌株进行检测和鉴定,结果与细菌分离鉴定吻合率为100%。表明本研究所建立的基于RA 16SrRNAPCR方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于RA感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

一种高效提取虎耳草科植物基因组DNA的方法

[目的]探索从虎耳草科植物中提取DNA的有效方法。[方法]采用改进的CTAB法,从11种虎耳草科植物中提取DNA。以提取的DNA为模板,利用通用引物"psbAF"和"trnHR"对虎耳草科植物叶绿体DNApsbA-trnH片段进行PCR扩增。[结果]通过该方法提取的DNA纯度较高,质量较好。用所得DNA进行psbA-trnH扩增的产量高,可用于后续的测序等分析。对山地虎耳草的PCR产物纯化后进行测序,得到262 bp的序列。将其与GenBank中的虎耳草属其他植物的psbA-trnH序列进行比对分析,证实该序列为目标psbA-trnH片段的区域。[结论]该方法可有效去除次生物质对DNA的干扰,提取的基因组DNA可用于叶绿体psbA-trnH测序分析和其他遗传学分析。     

不同产地山药不同分子量段多糖含量及活性的比较

为了比较怀山药与其他3种产地山药的不同分子量段多糖含量以及各山药多糖的活性,采取一步醇沉和分步醇沉法提取不同产地山药的4种山药多糖YPS_(总)、YPS_(40)、YPS_(60)、YPS_(80);用MTT法测定各山药多糖对PK-15细胞的安全浓度;然后分别从125μg/m L倍比稀释5个浓度,将4种山药多糖以先加山药多糖再加病毒的方式加至PK-15细胞培养体系中,用MTT法检测PK-15细胞活性,实时荧光PCR法检测PPV-SD1含量。结果表明:怀山药多糖各分子量段的多糖含量均高于其他产地山药,均以YPS_(80)分子量段的多糖含量最高,且以怀山药的YPS_(80)的增强细胞活性和抗PPV-SD1感染效果最好。可见怀山药的药效作用优于其他产地山药是有一定物质基础的。     

广东株家蚕微孢子虫特异DNA片段的克隆与序列分析

利用碱裂解方法抽提广东株家蚕微孢子虫(Nosema bombycis Naeegeli，N．b．)基因组DNA，通过PCR技术扩增得到了N．b．的一段特异DNA片段。对该目的片段的序列分析发现，该特异DNA片段大小为317bp，与Malone等报道的日本株N.b．特异DNA片段大小一致，但核苷酸序列同源性仅为92．1％。     

利用SCAR-PCR检测杂交油菜"蜀杂9号"的杂种纯度

用两个分别能在“蜀杂9号”父、母本之间稳定产生多态性的随机引物S18和S31,对父、母本DNA样品进行RAPD扩增,将得到的特异标记片段S18750和S31550进行回收、克隆和测序。根据测序结果设计序列特异性扩增(SCAR)引物SZ9SP1和SZ9SP2,将“蜀杂9号”的亲本RAPD标记转化为序列特异的SCAR标记。当用两对引物分别扩增杂种F1代单株总DNA时,能分别获得父、母本特异序列扩增带,表明获得的SCAR标记能可靠地用于“蜀杂9号”杂种纯度的检测。     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

超分支滚环扩增法检测小麦矮腥黑穗菌

 【目的】建立小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn,TCK）的超分支滚环扩增（hyper- branched rolling cycle amplification,HRCA）检测体系,为小麦矮腥黑穗病的鉴定以及早期诊断提供了一种新的稳定、可靠的检测技术。【方法】锁式探针包含一个公共连接序列和在探针两端与靶DNA序列互补的2个序列。根据TCK的差异序列设计锁式探针两端序列,以此为基础建立了TCK超分支滚环扩增反应体系。以优化的HRCA反应条件为基础,确定检测体系的特异性和灵敏度。比较HRCA体系和常规PCR体系的性能,并利用这2种体系对来自中国出入检验检疫局截获的51个小麦样品进行了验证检测。【结果】HRCA体系能专一地检出小麦矮腥黑穗菌的DNA靶带,而TCT、TCL等近源种及健康小麦样品都不能扩增。HRCA检测TCK靶序列质粒DNA的下限为1 fg?μl-1,检测基因组DNA的下限为10 pg?μl-1,检测灵敏度比常规PCR检测体系高10倍。HRCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和准确性,更适合于TCK的检测及鉴定。【结论】稳定、灵敏、特异的小麦矮腥黑穗菌的HRCA检测体系的建立,为小麦矮腥黑穗病的早期诊断及其近源种的多靶标检测提供了同步检测技术。     

随机扩增多态DNA(RAPD)技术及其在农业上的应用(综述)

随机扩增多态DNA技术是近年发展起来的一种DNA多态性检测技术。它以一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链(通常是十聚体)为引物,对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。扩增DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行DNA多态性分析,同RFLP及DNA指纹图谱法等其他DNA多态性检测技术相比,RAPD具有检测效率高、样品用量少、灵敏度高和检测容易的优点。RAPD技术已广泛的应用于农作物和畜禽品种及品系的遗传纯度的测定、品种和品系的鉴定、品种和品系遗传关系的确定、基因的定位和分离以及构建基因图谱等方面的研究。     

病木样本松材线虫DNA检测方法研究

松材线虫是我国禁止进境的检疫性有害生物,在形态学特征上和拟松材线虫很相似。为提高12I岸木材检疫中松材线虫鉴定速度和准确性,我们开展了从含线虫木样中直接检测松材线虫的初步研究。根据松材线虫和松树内其他寄生线虫核糖体DNA的ITS区序列差异,设计了松材线虫的特异性引物对BXF／BXR,并对7个松材线虫分离物、4个拟松材线虫分离物和1个待鉴定伞滑刃线虫分离物的基因组DNA进行PCR扩增,结果从所有松材线虫分离物中都扩增到长度约为580bp的特异性条带,而其他分离物没有扩增产物出现。采用CTAB法提取含虫病木样本总基因组DNA,用引物对BXF／BXR对不同稀释梯度的DNA样品进行扩增,当含虫木样总DNA被稀释到8倍以上时,可从DNA模板中扩增出特异性条带。特异性引物对BXF／BXR检测木样中松材线虫的灵敏度可达10条线虫／100mg木样。     

大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

向日葵黑茎病双重PCR检测实用化研究

本研究采用从新疆田间分离经ITS序列扩增、测序鉴定了的黑茎病菌株BXC1为供试菌,对其双重PCR分子检测、灵敏度试验以及模拟带菌组织的分子检测,再将此菌株采用不同接种方式人工接种2种向日葵品种幼苗,待其出现典型症状时,对其进行双重PCR实际检测。结果表明,无论是黑茎病菌基因组DNA、还是其与向日葵基因组的混合DNA都能扩增出真菌的ITS区特异带(580 bp)和黑茎病菌Actin基因的特异带(255 bp),且混合DNA还能扩增出向日葵的ITS特异带(约740 bp),说明向日葵黑茎病菌的此种双重PCR分子检测方法具有很好的特异性;梯级稀释真菌DNA或向日葵基因组DNA或其混合DNA模板的双重PCR检测表明,在20μl PCR反应体系中,黑茎病菌DNA的检测灵敏度均为0.05 ng/μl;接种了BXC1的向日葵,其带菌组织DNA均能检测出向日葵与黑茎病的ITS序列以及黑茎病Actin基因特异条带。这些结果表明,此向日葵黑茎病菌的双重PCR检测体系特异、可靠、便捷,可对带菌向日葵组织进行直接快速分子检测。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

杏RAPD两种凝胶电泳指纹特点及PCR扩增片段的序列分析

为更好地将RAPD技术应用于杏品种资源鉴定及遗传基础的研究,文章首次在选用11碱基长度引物的优化技术体系基础上,分别使用两种凝胶对16个杏品种RAPD的PCR扩增产物进行电泳检测与DNA指纹比较。结果表明,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出的谱带总数量以及多态性谱带的数量均高于琼脂糖凝胶,前者不存在或很少存在共迁移性的现象。根据两种电泳系统获得的标记信息对16个杏品种的遗传关系的分析发现,两者聚类结果存在一定差异。以此,提出了科学利用两种电泳的RAPD标记技术的策略。对随机挑选的24个片段进行克隆与测序,结果发现24个片段都是对应引物的RAPD扩增产物。在不同的11条序列中有3条是编码蛋白的基因片段,说明了RAPD不仅扩增基因组上的非编码蛋白序列,同时可以扩增编码蛋白的基因片段,能够较全面客观地反映不同杏品种间遗传上的差异。     

白菜核雄性不育两用系AFLP扩增特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从白菜核不育两用系"矮脚黄"可育系DNA中得到一个特异扩增片段MF-14.Southern杂交结果证实不育系也存在该片段的同源序列;回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-T Easy载体进行序列测定.测序结果表明,该片段全长289 bp,其碱基组成为A+T=46.02% .与白菜RAPD特异片段S107及其他育性相关基因核苷酸序列比较,同源性均低于50% .表明该片段为一新的序列.     

环介导等温扩增法（LAMP）检测最短尾短体线虫

为了快速、简便、准确地检测重要植物病原线虫—最短尾短体线虫（ Pratylenchus brachyurus ）,依据GenBank中短体线虫的线粒体DNA细胞色素氧化酶I（mtDNA COI）序列,设计了扩增最短尾短体线虫的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,并对LAMP反应条件进行优化,成功建立了一种可特异、快速检测最短尾短体线虫的LAMP体系。该体系在64℃下反应60 min,扩增效率最高。用琼脂糖凝胶电泳、酶切分析和SYBR Green I染色均能特异检测到最短尾短体线虫的扩增产物。所建立的LAMP体系能从供试的9种短体线虫和另外10种植物线虫中特异检测出最短尾短体线虫,其灵敏度可检测到1/200条线虫DNA,是常规PCR的10倍。表明本研究建立的最短尾短体线虫的LAMP检测体系,可用于最短尾短体线虫的快速检测。