转录调控因子Lmo2672对LM环境适应性和应激的调控作用

【目的】本文为了解AraC家族转录调控因子Lmo2672对单核增生李斯特菌(LM)环境适应性和应激的影响。【方法】利用温控型质粒pKSV7构建LM-Δlmo2672缺失株,比较母源株LM EGD-e和缺失株LM-Δlmo2672在不同应激环境中生长情况的差异,并利用qRT-PCR方法分析转录调控因子Lmo2672缺失对应激调控基因及氧化应激相关基因转录水平的影响。【结果】与LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672在37、42℃及含5%NaCl、0.3%胆酸盐、5 mM H_2O_2、1%Triton X-100的培养基中生长速度均显著降低(P0.05);且环境适应性及应激相关基因(prfA、lexA、fri、perR、kat、sod)转录水平显著降低(P0.05)。【结论】提示lmo2672基因在LM环境适应性和应激中发挥重要的调控作用。     

禽致病性大肠杆菌ETT2转录因子eivF缺失株的生物学特性及转录组学分析

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建APEC ETT2转录因子eivF基因缺失的APEC AE81△eivF株及其回复株AE81 C-eivF,通过运动性、生物被膜形成等试验分析eivF对APEC生物学功能的影响;并利用转录组学方法分析eivF在转录调控网络中对细菌鞭毛和生物被膜等相关因子的转录调控作用。【结果】成功构建了APEC eivF基因缺失株AE81△eivF和回复株AE81 C-eivF;生物学结果表明,与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF运动能力降低,生物被膜形成褶皱堆砌且厚度增大,空间结构呈立体、多层次状,并形成类似于三维塔状结构的突起,回复株AE81 C-eivF运动能力和生物被膜形成能力基本恢复;与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF有576个基因差异表达,且鞭毛和生物被膜等相关基因在转录水平上均发生显著变化。【结论】ETT2的转录因子eivF参与调控APEC的生物表型变化,其可能通过调控鞭毛、生物被膜相关基因而调控APEC致病过程。     

丝氨酸/苏氨酸激酶对猪链球菌2型应激和毒力的影响

为阐明丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)对猪链球菌2型强毒株的应激耐受和毒力的影响,比较了亲本株SS2-1及其丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失株Δstk在各种应激环境(热、酸、氧化应激和高渗应激)中的生长能力,利用HEp-2细胞模型比较各菌株的黏附能力,比较各菌株在猪全血中的存活能力,利用仔猪模型评价STK基因缺失前后细菌的毒力差异。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失后,细菌在各种应激环境中的生存能力明显减弱,对HEp-2细胞的黏附能力减弱,在猪全血中的存活能力显著降低,对仔猪的致病力明显降低。此外,缺失株Δstk在仔猪体内各器官的定殖能力也显著降低。说明丝氨酸/苏氨酸激酶与猪链球菌的应激和毒力密切相关。     

果生炭疽菌转录因子CfHac1的BRLZ结构域生物学功能研究

  目的  炭疽病是油茶的主要病害,导致巨大的经济损失。果生炭疽菌是油茶炭疽病优势致病菌。对果生炭疽菌的转录因子CfHac1的结构域进行分析,为进一步解析转录因子CfHac1调控病菌致病的分子机制奠定基础,对挖掘油茶炭疽病防控新途径具有重要的理论意义。  方法  采用点突变技术构建转录因子CfHac1结构域缺失载体,通过PEG介导法将该回补载体转化至CfHAC1基因完全缺失突变体的原生质体中,通过博来霉素抗性和荧光筛选获得结构域缺失回补菌株,进一步研究BRLZ结构域在果生炭疽菌中的生物学功能。  结果  结果发现转录因子CfHac1含有一个碱性亮氨酸拉链结构域（BRLZ）,该结构域包含58个氨基酸残基;与野生型菌株和完全互补菌株相比,BRLZ结构域缺失突变株ΔCfhac1ΔBRLZ生长速率显著降低,分生孢子产量显著减少,不能形成附着胞,对内质网压力胁迫更敏感,丧失对油茶叶的致病力,其表型与ΔCfhac1突变体一致。  结论  上述结果表明,BRLZ是转录因子CfHac1重要的结构域,对CfHac1在果生炭疽菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。      

sRNA STnc440分子特征及对鼠伤寒沙门菌毒力的影响

【目的】探究鼠伤寒沙门菌(STM)sRNA STnc440的分子特征及对细菌毒力的影响,为进一步揭示STnc440的调控机制奠定基础。【方法】克隆STnc440基因序列并进行分子特征分析,采用λ-Red重组技术构建了STnc440缺失株△STnc440和回补株△STnc440/STnc440,通过细胞侵染和小鼠感染试验研究STnc440对STM毒力的影响,预测分析STnc440调控的靶基因。【结果】sRNA STnc440基因大小为81 bp,上游序列含有-10 box和-35 box启动子核心区域,遗传进化分析表明该基因在沙门菌属中相对保守。与STM亲本株和回补株相比,缺失株△STnc440在生长特性上无明显差异,对巨噬细胞的粘附能力和侵袭力显著减弱,LD_(50)显著升高,在小鼠肝脏和脾脏中的定殖能力均显著降低(P0.05)。靶基因预测分析发现,STnc440的靶基因可能为SL1344_2880(Ⅰ型毒力岛蛋白)。【结论】sRNA STnc440对STM毒力有一定的调控作用,可能通过调控SL1344_2880来实现。     

猪链球菌4型转录调控因子GalR的生物学特性

【目的】 研究分析猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据。【方法】 利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因缺失株SH1510ΔGalR,通过GalR基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510ΔGalR。对亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5×10 ⁹、5×10 ⁸、1×10 ⁸、2×10 ⁷ CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD₅₀。将浓度为2×10 ⁷CFU/mL的亲本株和缺失株1﹕1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2 h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力。【结果】 使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510ΔGalR检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鉴定缺失株SH1510ΔGalR,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符。Western blotting 鉴定结果表明亲本株SH1510可与粗制GalR多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510ΔGalR没有条带出现。PCR和Western blotting鉴定结果均表明缺失株SH1510ΔGalR已构建成功。亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD₆₀₀值明显低于亲本株。另外,从最高OD₆₀₀值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖>蔗糖>D-半乳糖。 小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD₅₀分别为1×10 ⁸CFU和1.62×10 ⁸CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著（P＜0.01）。全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2%,缺失株的存活率为27.3%,缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降（P＜0.05）。【结论】 GalR 基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用。     

超氧化物歧化酶在酿酒酵母碱胁迫抗性中的功能研究

[目的]研究酿酒酵母超氧化物歧化酶与其碱胁迫抗性的相关性。[方法]采用可见分光光度法,测定碱胁迫条件下酵母菌超氧化物歧化酶活性（SOD）指标;采用平板滴定生长试验,检测酿酒酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株（sod1Δ）和锰超氧化物歧化酶缺失菌株（sod2Δ）的碱胁迫抗性;采用台盼蓝染色,检测碱胁迫条件下酵母细胞的存活率。[结果]在pH值为7.9条件下处理2h可明显诱导酵母细胞内SOD活性升高;与野生型酵母菌株相比,sod1Δ和sod2Δ基因缺失菌均表现碱胁迫敏感表型,并且碱胁迫条件下细胞存活率明显下降。[结论]超氧化物歧化酶在调控酿酒酵母碱胁迫抗性中发挥重要作用。     

嗜水气单胞菌双组分系统EnvZ/OmpR功能探究

为探究嗜水气单胞菌双组分系统的调控功能,通过同源重组法敲除嗜水气单胞菌双组分基因envZ/ompR,检测各菌株在不同盐浓度胁迫条件下的生长情况,采用结晶紫染色法比较各菌株的生物被膜形成能力,通过全血共培养试验评估各菌株抵御鱼血杀伤的能力;比较不同菌株感染斑马鱼的半数致死量（LD50）,通过草鱼组织载菌量评判各菌株的侵袭能力,采用荧光定量PCR检测各脏器的促炎因子的转录水平。结果显示,在不同盐度条件下嗜水气单胞菌双基因缺失株ΔenvZ/ompR的生长没有显著差异,而其下游基因ompF和ompC的转录水平显著受到影响;ΔenvZ/ompR株的生物被膜形成能力以及抗鱼全血杀伤能力相较野生型都显著下降。ΔenvZ/ompR的斑马鱼刮伤感染LD50较野生型增长了4.8倍,致病力减弱,在草鱼腹腔感染中其全身扩散能力也较野生株显著减弱,并且ΔenvZ/ompR感染组草鱼脾脏、肝脏和肾脏中促炎因子TNF-α和IL-6的转录水平相对于野生株感染组均显著降低。上述结果表明嗜水气单胞菌双组分系统EnvZ/OmpR参与响应渗透胁迫,参与调控生物被膜形成,且在致病过程尤其是在宿主体内系统扩散过程中发挥重要作用。     

lmo2672基因缺失对LM在不同环境下生物被膜形成的影响

旨在了解AraC家族转录调控因子 lmo2672对单核增生李斯特菌(LM)生物被膜(BF)形成的影响。根据同源重组技术构建LM-△ lmo2672基因缺失株,利用结晶紫染色法比较LM EGD-e和LM-△ lmo2672在不同温度、渗透压、H_2O_2和胆酸盐环境中BF形成量的差异;通过qRT-PCR分析上述不同应激环境中BF相关基因相对转录水平的变化。研究结果证实:与LM EGD-e相比,LM-△ lmo2672在4℃,30℃,5%NaCl,8%NaCl,5mmol/L H_2O_2和0.3%胆酸盐培养环境中BF形成量显著降低;在37℃LM-△ lmo2672 BF形成能力极显著降低;在不同应激环境中,LM-△ lmo2672 BF形成相关基因的表达量均出现不同程度下降。研究结果表明, lmo2672基因在LM BF形成过程中发挥重要作用。     

DREB转录因子与植物非生物胁迫抗性研究进展

转录因子在调节植物生长发育以及植物对外界环境胁迫的响应方面起着重要作用。DREB转录因子含有一个保守的AP2/EREBP结构域,参与外界环境胁迫的应答响应,通过结合DRE(Dehydration responsive element)顺式作用元件,调控下游胁迫相关基因的转录表达,改良植物的抗性。就DREB转录因子的结构特点、表达调控以及提高转基因植株胁迫耐受性的最新研究成果进行了评述。     

苏州近郊4种不同森林群落稳定性研究

稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

新疆野生樱桃李PsoRPM2与PsoLFY互作调控植株开花的分子机制

为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象，本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型，早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花，而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花，并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中，PsoRPM2基因表达高于晚花，同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示，PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上，新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作，提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达，从而加快花芽分化进程，导致植株提前开花。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。