甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立

 【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病（sugarcane mosaic virus,SCMV）和宿根矮化病（ratoon stunting disease,RSD）的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种（Leifsonia xyli subsp. Xyli,Lxx）的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV（400 bp）和RSD（265 bp）2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。     

玉米矮花叶病病原河北株系的分子鉴定和外壳蛋白基因的序列分析

从河北省石家庄地区田间表现典型的矮花叶症的玉米病叶中得到分离物MD-HB,按照报道的马铃薯Y病毒属CP基因前后保守区序列的比较,设计合成了一对引物,采用RT-PCR法扩增了1 2kb的全长外壳蛋白(CP)和病毒基因组的3′末端非编码区(3′-URT)的cDNA序列,将其克隆到pGEM-T载体上,并进行序列分析。结果表明,CP基因由939个碱基组成,编码313个氨基酸并含有与蚜虫密切相关的DAG(Asp-Ala-Gly)序列。Nib/CP基因交界处的蛋白酶切位点为Q/S。与侵染禾本科作物的马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的4种病毒代表株系甘蔗花叶病毒(SCMV-Ger)、SCMV-MDB、玉米矮花叶病毒(MDMV-A)、高粱花叶病毒(SrMV-H)和约翰逊草花叶病毒(JGMV-O)对应的序列进行比较,结果核苷酸序列的同源性依次为94 4%、84 3%、67 5%、74 2%和60 1%,氨基酸序列的同源性依次为95 5%、87 9%、67 1%、70 3%和58 8%;另一方面,此病毒分离物与来自甘蔗的SCMV株系SCMV-A和MDMV-SC的核酸序列及氨基酸序列的同源性分别为82%、81 1%和83 1%、82 8%,说明它们具有较远的亲源关系。认为应将我国SCMV玉米分离物单独从SCMV划分出来,作为SCMV亚组的一个新病毒种而不是SCMV的一个株系。     

广西蔗区甘蔗花叶病病毒种群分析

[目的]明确引起广西蔗区甘蔗花叶病的病原,为甘蔗抗花叶病育种、种质筛选及病害防控提供科学依据.[方法]从广西主要蔗区采集不同品种显症或不显症甘蔗叶片,提取RNA后采用甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮化病毒(MDMV)和约翰逊草花叶病毒(JGMV)特异引物进行一步法RT-PCR检测,将目的片段克隆并测序;病毒CP基因序列在GenBank数据库中进行比对分析.[结果]在收集的48份样品中检测出SrMV阳性33份,SCMV阳性2份,SCMV和SrMV复合侵染1份,未检测到MDMV和JGMV.花叶病的发病率为75.0％,其中,SrMV、SCMV及两种病毒复合侵染的发病率分别为68.8％、4.2％和2.1％.台糖系列及其他引进品种的甘蔗花叶病感病率较高,桂糖系列品种的感病率相对较低.[结论]甘蔗花叶病已在广西大部分蔗区发生,其致病原以SrMV为主,SCMV零星发生,由SCMV和SrMV复合侵染的甘蔗花叶病发生机率较低.广西蔗区可能存在其他种类病原病毒引起的甘蔗花叶病.     

高粱红条病病原的分子鉴定

从山西高粱红条病病叶中得到一种病毒分离物,命名为GL-SX.根据甘蔗花叶病毒亚组(SCMV subgroup)外壳蛋白(CP)基因C-端和复制酶(NIb)基因C-端的保守序列设计引物,对GL-SX进行免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增,获得一条长约1.1 kb的扩增片段,扩增片段克隆后测定序列,该序列含1087个核苷酸(nt),编码362氨基酸(aa),取其中的近全长CP氨基酸序列(296 aa)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) 等4种病毒的对应序列进行同源性比较,结果与SCMV的同源性最高(95.3%),而与SrMV、MDMV和JGMV等3种病毒的同源性相对较低,依次为69.3%、69.1%和55.4%.根据Potyvirus属病毒种类划分的标准,将GL-SX鉴定为SCMV.将GL-SX的近全长CP氨基酸序列与SCMV种内各分离物的对应序列进行同源性比较及构建关系树,结果显示GL-SX与SCMV-MDB具有较远缘的种内亲缘关系,而与德国的一个SCMV玉米分离物(SCVM-Hoe)及中国的两个玉米分离物(SCMV-ZJ和SCMV-BJ)具有很高的同源性.     

广州地区SCMV玉米分离物外壳蛋白基因的序列分析及其引致的生理病变

外壳蛋白(CP)基因序列分析结果表明,广州地区甜玉米上的甘蔗花叶病毒(SCMV)分离物属于玉米变异组,与我国其他地区玉米上的SCMV分离物有较大差异。其CP基因核苷酸同一率与广东甜玉米分离物(AJ310105)为91.6%,而与我国其他地区玉米分离物同一率为85.1%-87.1%。通过对该分离物侵染甜玉米所致的细胞病变进行超薄切片电镜观察,结果表明,除多种细胞器病变外,还有4种类型的内含体,即风轮体、卷筒体、束状体和片层集聚体,部分束状体与胞间连丝相连,可能与病毒胞间运转有关。该分离物机械摩擦接种侵染甜玉米后,引致寄主植物叶组织PAL和SOD酶活性较大的变化,其中PAL活性在侵染早期比对照低,随后比对照高,SOD活性比对照稍高,而POD和CAT酶活则与对照无显著差异。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

近红外漫反射光谱法测定青贮玉米品质性状的研究

【目的】研究利用近红外漫反射光谱法（NIDRS）测定青贮玉米的体外干物质消化率 (IVDMD)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维 (ADF)、粗蛋白（CP）和粗脂肪（EE）含量的可行性。【方法】以普通、高油和超高油玉米全株和秸秆的青贮样为材料，采用光谱的主成分空间技术和偏最小二乘回归法（PLS）。【结果】所建立的IVDMD、NDF、ADF、CP和EE的校正模型的交叉验证决定系数(R2cv)分别为0.9133、0.9764、0.9789、0.9254和0.7294，外部验证决定系数(R2val)分别为0.8879、0.9455、0.9635、0.9387和0.7333，各项误差(RMSEE、RMSECV和RMSEP)为0.24(CP)～2.23(NDF)。【结论】利用近红外漫反射光谱法测定青贮玉米品质性状是完全可行的，该结果可满足畜牧业对青贮饲料品质快速分析的需要，对青贮玉米育种材料的快速鉴定筛选具有重要的意义。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

劳氏黏虫在4种寄主植物上的生长发育和繁殖

【目的】明确寄主植物对劳氏黏虫Leucania loreyi(Duponchel)生长发育和繁殖的影响。【方法】在温度(24±1)℃、湿度(75±5)%、光周期为12 h光∶12 h暗的室内条件下,分别以玉米、水稻、甘蔗和稗草叶片为寄主植物,观察劳氏黏虫各虫态发育历期、存活率、蛹质量、成虫繁殖力并计算生命表参数。【结果】劳氏黏虫幼虫历期取食玉米时间最短,为20.18 d,取食甘蔗时间最长,为25.24 d。非成虫期存活率在玉米上最高(68%),在稗草上最低(58%);雌成虫蛹质量以取食玉米的最高(32.43 mg),取食稗草的最低(22.61 mg);取食玉米的产卵量最多,单雌产卵量为1 019.42粒,取食甘蔗的产卵量最少,单雌产卵量为665.27粒。劳氏黏虫在玉米、水稻、甘蔗和稗草上的内禀增长率(rm)分别为0.13、0.12、0.10和0.10,净增殖率(R0)分别为226.54、211.48、153.71和171.85。【结论】在4种寄主植物中,玉米为劳氏黏虫最优寄主,其次是水稻,甘蔗和稗草可作为寄主或中间寄主。     

禾谷刺盘孢菌在侵染早期与玉米蛋白的互作预测与分析

【目的】研究禾谷刺盘孢菌与寄主玉米的蛋白互作关系,有助于从分子水平了解病菌致病过程及病菌-寄主互作机制。【方法】采用计算方法预测病菌侵染相关蛋白与寄主玉米蛋白的互作,并结合网络可视化工具和GO注释信息对参与互作的蛋白进行深入分析。【结果】预测结果包含了355对互作蛋白,涉及16个刺盘孢菌蛋白和173个玉米蛋白,其中刺盘孢菌蛋白为蛋白酶、锌羧肽酶、木聚糖酶等潜在的致病蛋白,而病菌靶向的寄主蛋白涉及对真菌防御响应、蛋白折叠、蛋白修饰等多种生物过程。对互作蛋白信息的分析则表明预测方法既识别到已知互作,如病菌木聚糖酶与寄主木聚糖酶抑制蛋白的互作,也发现了不少新互作蛋白。【结论】这些结果为明确禾谷刺盘孢菌在侵染早期与寄主的互作机制提供了有用信息。     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

甘蔗花叶病毒(SCMV)种群结构分析

针对已公布的18个甘蔗花叶病毒(SCMV)全基因组序列,利用MEGA 5.1分析了其11个蛋白(P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、Nib、CP-C和多聚蛋白)编码基因所受的选择压,并结合其编码蛋白的功能,预测了部分基因在SCMV进化过程中的角色和变异位点.结果显示:P1和CP-N端的变异性程度较大,P1蛋白多样性最高;CP-C端变异性和多样性均较低;PIPO受到的选择压最小,但多样性最低,可能是由于PIPO与P3共用一段编码序列.来源于甘蔗的SCMV多聚蛋白的第2 853、2 897和2 904个氨基酸位点(在CP中部)分别为T、R和E,而来源于玉米的SCMV多聚蛋白对应的氨基酸位点分别为S、K和D,表明这3个位点具有寄主依赖性.     

甘蔗花叶病毒株系研究初报

以甘蔗品种CP31/294、CP3 1/588和 Co281,甜高粱品种 Rio 和 Atlas 为鉴别寄主,测定出福建、广西主要蔗区甘蔗花叶病的10个供鉴病毒分离物中,有8个与 Abbott 鉴别系统描述的 SCMV-A 株系一致;1个与 SCMV-D 株系一致;1个与已知的14个株系都不相同,表现弱毒性,可能是新株系。应用辅助鉴别寄主甘蔗品种 F134,在鉴定为 SCMV-A 株系的8个分离物中,区分出一个新的分离物。     

玉米抗甘蔗花叶病毒SCAR分子标记开发

 【目的】玉米矮花叶病（由甘蔗花叶病毒引起）是中国和欧洲玉米产区的重要病害,开展分子标记辅助育种可以明显提高抗病育种效率。【方法】本文采用改进的BSA法（bulked segregant analysis,BSA）构建玉米抗感自交系DNA池,结合AFLP技术筛选多态性标记,转化后获得实用性强的SCAR标记,并借助100份自交系抗性鉴定结果对SCAR标记进行相关验证。【结果】获得了2个多态性稳定的AFLP标记P66M38-220和P55M51-240,其中将P66M38-220转化为SCAR112标记,此标记与甘蔗花叶病毒抗性高度相关。【结论】改良BSA法是一种发掘性状基因紧密连锁标记的有效方法;开发的SCAR112 标记可以用于玉米抗甘蔗花叶病毒的分子标记辅助选择。     

甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及系列表达载体的构建

采用RT-PCR法,从表现玉米矮花叶病症状的玉米叶片中克隆了外壳蛋白(Coat protein)基因。测序和同源性比较结果表明:所克隆的CP基因来自甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)MDB株系,编码219个氨基酸。以CP基因为目的基因,构建了用于基因枪转化的p35SCPfBar,p35SCPrBar,pUbiCPfBar,pU-biCPrBar 4个表达载体和用于农杆菌转化的pCAMBIACPf,pCMABIACPr 2个表达载体。     

基于外壳蛋白核酸序列的中国黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物起源分析

以直接从中国进口源性葫芦种子中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得种子上携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(CP)基因(LHP,Liaoning cucurbits seed protein ),将其克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明该CP基因(GenBank登陆号:DQ997778)由483个核苷酸组成,编码161个氨基酸.对包括该分离物在内的19个CP基因核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合寄主来源及地域来源进行LHP的起源分析,结果表明黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物的序列分群和进化关系与上述两个因素无明显关系.     

甘蔗花叶病毒河南分离物HC-Pro基因的序列分析及其RNA沉默表达载体构建

采用RT-PCR方法从河南地区甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)感染的玉米叶片中,克隆了辅助成分-蛋白酶基因(helper component.proteinase,HC-Pro).该基因长1 380 bp,编码460个氨基酸.序列比对表明.HC-Pro编码的氨基酸序列与北京、山东地区SCMV分离物的相似性分别达到97%和98%.而与以前数据库登录的河南分离物的相似性仅98%,说明河南地区SCMV可能发生了变异.选取长582 bp的HC-Pro片段,构建了表达发夹RNA的基因沉默双元表达载体pRNAi-HC-Pro(±),成功转化了农杆菌LBA4404.