甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

高粱红条病病原的分子鉴定

从山西高粱红条病病叶中得到一种病毒分离物,命名为GL-SX.根据甘蔗花叶病毒亚组(SCMV subgroup)外壳蛋白(CP)基因C-端和复制酶(NIb)基因C-端的保守序列设计引物,对GL-SX进行免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增,获得一条长约1.1 kb的扩增片段,扩增片段克隆后测定序列,该序列含1087个核苷酸(nt),编码362氨基酸(aa),取其中的近全长CP氨基酸序列(296 aa)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) 等4种病毒的对应序列进行同源性比较,结果与SCMV的同源性最高(95.3%),而与SrMV、MDMV和JGMV等3种病毒的同源性相对较低,依次为69.3%、69.1%和55.4%.根据Potyvirus属病毒种类划分的标准,将GL-SX鉴定为SCMV.将GL-SX的近全长CP氨基酸序列与SCMV种内各分离物的对应序列进行同源性比较及构建关系树,结果显示GL-SX与SCMV-MDB具有较远缘的种内亲缘关系,而与德国的一个SCMV玉米分离物(SCVM-Hoe)及中国的两个玉米分离物(SCMV-ZJ和SCMV-BJ)具有很高的同源性.     

江苏玉米矮花叶病病原鉴定

可以感染玉米引起花叶症状的病毒有玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)和高粱花叶病毒(SrMV)等4种,目前国内主要认为是SCMV.为明确江苏发生的玉米矮花叶病的病原,2011年从姜堰田间采集自然发生的呈现玉米矮花叶病典型症状的玉米病叶,初提纯物电镜观察可见750 nm×13 nm线状病毒粒子.根据已经发布的SCMV设计特异性引物,通过RT-PCR扩增获得预期的CP、HC-Pro、NIb和Vpg基因片段,而用MDMV、JGMV和SrMV特异性引物未扩增到预期目的片段.序列测定和同源性分析表明,扩增到的基因片段序列与SCMV对应基因片段序列的同源性在90％以上,与SCMV亚组中另外3个株系MDMV、SrMV和JGMV相应基因片段序列的同源性在80％以下.由此判断姜堰玉米矮花叶病的病原为SCMV.     

甘蔗花叶病毒复制酶基因的克隆及序列分析

以甘蔗花叶病毒(SCMV)福建分离物(FJ)的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增了含有复制酶(NIb)基因的DNA片段,将其克隆到质粒pGM-T载体上并进行了序列分析。结果表明,NIb基因由1563个碱基组成,编码521个氨基酸并含有高度保守序列GDD。NIa/NIb和NIb/CP交界处的蛋白酶切割位点分别为Q/C和Q/A。与国外报道的SCMV亚组几个株系分离物相比,NIb基因(福建分离物)的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为57.8%~86.9%和60.9%~95.2%,其中与SCMV-SA株系的核苷酸及氨基酸序列同源性则高达86.9%和95.2%。     

辣椒CMV广州分离物的CP基因序列分析及亚组鉴定

从广州市呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到1个黄瓜花叶病毒的分离物(CMV-GZ)。利用RT-PCR技术克隆了该病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因,其序列长度为657 bp,编码218个氨基酸。对CP基因序列进行同源性比较分析,结果表明该病毒分离物的CP基因与CMV亚组Ⅰ5个株系的同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ4个株系的同源性均低于80%。据此将该分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

鲁粤两省黄瓜花叶病毒辣椒分离物CP基因序列分析及亚组鉴定

从广东和山东呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到2个黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的分离物.利用RT-PCR技术克隆了病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因.核苷酸序列测定表明,CMV-GDLJ和CMV-SDLJ 2个病毒分离物CP基因序列长度为657bp,编码218个氨基酸.2个病毒分离物的CP基因序列与CMV亚组Ⅰ的6个株系CP基因序列同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ的3个株系同源性均低于80%,据此将分离物CMV-GD和CMV-TA归属于CMV亚组Ⅰ.     

黄瓜花叶病毒紫松果菊分离物外壳蛋白特性分析

以紫松果菊上分离的黄瓜花叶病毒2-1-2的RNA为模板,采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应,下同)技术对2-1-2的外壳蛋白(coat prote in,CP)基因进行了克隆和序列测定。该CP基因全长657个碱基,编码218个氨基酸。其核苷酸序列和推导的氨基酸序列与亚组I代表株系Fny的同源性分别为94.5%和98.1%,与亚组II代表株系Q的同源性分别为77.7%和82.5%。对包括该分离物在内的20个CP序列与地域之间的关系进行了分析,结果表明CMV不同分离物的亚组类型与地域无明显关系。     

甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及系列表达载体的构建

采用RT-PCR法,从表现玉米矮花叶病症状的玉米叶片中克隆了外壳蛋白(Coat protein)基因。测序和同源性比较结果表明:所克隆的CP基因来自甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)MDB株系,编码219个氨基酸。以CP基因为目的基因,构建了用于基因枪转化的p35SCPfBar,p35SCPrBar,pUbiCPfBar,pU-biCPrBar 4个表达载体和用于农杆菌转化的pCAMBIACPf,pCMABIACPr 2个表达载体。     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

黑皮果蔗花叶病病原鉴定

在南宁市郊采集到l份表现褪绿条纹、花叶的黑皮果蔗样品(NN-Ba2),经差速离心和PEG二次沉淀法提取病毒粗汁液,在电镜下观察到略弯曲的线状病毒粒子;DAC-ELISA检测显示NN-Ba2与甘蔗花叶病毒多克隆抗体和单克隆抗体呈阳性反应;根据SCMV和SrMV CP基因分别设计合成特异引物,利用RT-PCR对NN-Ba2进行分子鉴定,扩增出大小约900 bp的预期片段,健康对照未扩增到任何片段;NN-Ba2扩增片段经克隆后测序得到719个有效核苷酸,测序结果在DDBJ上用BLAST进行同源性分析,结果显示该序列与已报道的SCMV广东、云南、广西等地分离物对应的核苷酸序列同源性为97.36%~97.77%,根据马铃薯Y病毒科(Potyviridae)病毒种和株系的划分标准,NN-Ba2鉴定为SCMV.田间采集的另外10份表现花叶症状的果蔗样品经ELISA和RT-PCR检测,证明也感染了SCMV.     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

Cloning of Thymidine Kinase Gene of Duck Plague Virus Using Degenerate PCR

The DNA of duck plague virus （DPV） thymidine kinase （TK） gene was cloned and sequenced from a vaccine virus in the study. Degenerate oligonucleotide primers for the consensus site of herpesvirus UL24, TK, and glycoprotein H（gH） gene were used in the polymerase chain reaction （PCR） to amplify DNA product with 3 741-base-pairs （bp） in size. DNA sequence analysis revealed a 1 077-base-pairs （bp） open reading frame （ORF） encoding a 358 amino acid polypeptide homologous to herpesvirus TK proteins. The predicted TK protein shared 31.2, 41.3, 35.7, 37.4, and 28.4% identity with herpes simplex virus typel, equine herpesvirus type 4, Marek＇s disease virus 2, herpesvirus turkey, and infectious laryngotracheitis virus, respectively. Comparison of the amino acid sequences of other herpesvirus TK proteins showed that these proteins were not conserved on the whole, otherwise the portion of the TK proteins corresponding to the nucleotide binding domain and the nucleoside binding site were highly conserved among herpesvirus. Comparison with the amino acid sequences of the conserved nucleotide and nucleoside binding domains of other eleven herpesvirus TK proteins to the predicted DPV peptide confirmed its identity as the DPV TK protein.     

侵染中国甘蔗和玉米的SCMV CP基因序列多样性分析

【目的】揭示侵染中国甘蔗及玉米的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）的遗传多样性，为抗病品种培育及病害综合防治提供依据。【方法】以病株叶组织总RNA抽提物为模板，通过RT-PCR扩增及扩增产物直接测序获得了华南地区SCMV 26个甘蔗及玉米田间分离物的近全长CP基因序列，结合GenBank中已公布的部分相应序列，采用序列比对及分子系统进化树重建方法，对SCMV CP基因序列的变异性进行分析。【结果】中国SCMV可分为3个分子组群，各组群分别对应于各自来源的寄主，即杂种甘蔗(糖用甘蔗, Saccharum interspecific hybrids)、玉米(Zea mays)和高贵甘蔗（果用甘蔗,Saccharum officinarum）。CP基因核苷酸同一性，不同组群之间为78%～84%，同一组群内部各分离物之间大于91%。在分子系统进化树中，这3个分子组群各自聚集成簇，前两个组群分别隶属于Alegria等（2003）建立的甘蔗组（sugarcane group，SCE 组）和玉米组（maize group，MZ组），第3个组群为本研究首次发现，命名为高贵甘蔗组（noble sugarcane group，NSCE组）。侵染杂种甘蔗的SEC组不存在明显的地域分化，而侵染玉米和高贵甘蔗的MZ组和NSEC组则可对应地理来源分为若干亚组，前者可分为华东华中亚组、西北西南亚组及华南亚组，后者至少包括华南亚组和浙江亚组。在玉米、杂种甘蔗及高贵甘蔗混栽区，不同作物上的SCMV可以通过蚜虫传播而交叉侵染，但各组群间依寄主种类存在相对隔离现象。本研究还发现中国华南地区，SCMV可自然侵染甘蔗近缘属杂草河八王（Narenga sp.）和芒（Miscanthus sp.）。【结论】在中国，SCMV存在丰富的遗传多样性，其分化与寄主类型密切相关，可分为杂种甘蔗组、玉米组和高贵甘蔗组，其中玉米组和高贵甘蔗组又可根据地理来源分为若干亚组。在抗病品种的选育及病害综合防治中，必须充分考虑到病毒的这种分化现象。     

猪源冠状病毒ORF3和ORF7的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株全序列对TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)TS株的ORF3和ORF7各设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增分别获得了1 487 bp和516 bp大小的两个片段,与预期结果大小相符.TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3a核苷酸序列同源性分别为99.1%、93.0%、95.9%、94.4%,相应的氨基酸同源性分别为97.3%、87.8%、93.2%、91.8%,TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3b核苷酸序列同源性分别为99.5%、98.5%、97.0%、97.8%,相应氨基酸的同源性分别为98.4%、96.3%、94.3%、95.8%,而TS株与PRCVIA1894株的ORF3b核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%和93.9%.TS株ORF7没有发生缺失且和其他毒株有很高的同源性.结果表明:TGEV非结构蛋白高变区在ORF3a第192个碱基至终止密码子之间,TGEV和PRCV在编码ORF3b氨基酸的数量和RNA酶结合位点上有一定的差异.     

犬细小病毒BJ5株分离和VP2序列分析

从北京地区疑似犬细小病毒感染的病死犬血样粪便中分离1株犬细小病毒并进行VP2基因扩增和序列分析,命名为CPV—BJ5株。应用CrFK细胞分离病毒,经2次传代后出现稳定的血凝特性（HA）;免疫荧光试验表明,感染分离毒的细胞与抗CPV单克隆抗体反应并出现特异性的胞浆荧光;试验犬接种分离病毒后14d内均表现为体温升高、食欲减退、腹泻及血便等典型发病症状;序列测定结果表明分离病毒的VP2基因与CPV-15、CPV-020、CPV-NJ、CPV—HLJ-JQ株的核苷酸相似性分别为99．2％、99．5％、99．1％、99．9％,氨基酸相似性分别为99．5％、100％、100％、99．3％;与CPV—Northern、CPV-39株的VP2基因核苷酸相似性为98．9％、98．1％,氨基酸相似性为98．8％、99．5％。表明该分离病毒与CPV-15、CPV-020、CPV—NJ、CPV—HU—JQ株在基因型上同属于CPV-2a毒株。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。